侧耳纤维二糖水解酶基因的克隆和表达研究.pdfVIP

食用菌 全国第六届食用菌学术研讨会论文集 200l(增刊， 侧耳纤维二糖水解酶基因的克隆与表达研究‘ 扬国良 李丽挪 陆师义 艾福彪 杨秀琴 (河北大学生物技术中心．保定07l002) 摘要：pDLl是能够转化细前和真茁的双功能瞳粒．将 醇一4000：sjgma公司产品{青霉索及新霉宗．中国 pDl．1与糙皮侧耳【P打“mf…w”a蛐J的DNA片段连接． 卫生部药物检定研究所标准品；电泳、层析所用试剂 然后转化玉米黑耢苗(u“i，“g…“，拈)的原生质_l奉．通过新 分别酌自美国Promega公司、slgnla公司}试剂盒： 霉誊琏择平皿的筛j盎．转化率达到800转化于／pgDNA．建 立丁糙盘伽耳的基因文库．随机取15个转化于进行点渍怯 Primega—Gene LabeIj“gsystem购自美国Prom89a ‘n。ui“gblotti咄)植验．结果均星阳性．此结果表明．抗性 公司；同位紊：(一32PdATP、(一32PdCTP均为 克障不是螺于玉米黑粉茁敬感细胞的回复突变．萨慎法 Sigma公司产品。 ‘southtrn bIotti“R)检验显示．车研究在玉米磊柑菌细胞中 x一光片：日 克鹿植皮帕耳纤维=糖水解酶基因是成功的．基因表达试 硝酸纤维滤膜，Sigma公司产品F 齄表明．玉米纛粉商克窿株具有植皮倒耳纤雄二糖水解酵 FiIm 本FUJr c。．．LTD产品． 的活性． reesei)．cBH 探针：李氏术霉(Trichoderma I： 差■堋t植皮侧耳；玉米黑粉茁·纤维二糖水解酶；基因克 5’端EcoR I— 隆 l—Hindl片段34bp；3’端BamH 应用基因工程技术研究食用菌纤维索酶系的基 reesei)．CBH I—Ava I：s’端xba I片段35bp{3’ 因克隆与表选，首先要建立一套有效的基因转化系 端AccI—H眦_片臣450bp．上述探针均为sI窖ma 统。玉米黑粉苗和糙皮侧耳都是担子菌，但前者营寄 公司产品．1．2技术路线以pDLl质粒为载体，玉米 生而缺少纤维索酶系．因此可作为糙皮侧耳纤维索 黑粉菌为受体，克隆糙皮侧耳纤维二糖水解酶cBH 酶基因克隆的受体菌株=】。‘o。在实验室条件下．玉米 I基因的技术路线如图l所示． 黑粉菌能在基本培养基上生长，并分为单倍体和双 2结果与讨论 倍体两个生长耕。单倍体的吠生孢子在培养基上似 酵母状生长．易于操作。因此，长期以来人们把它作 2．1 pDLl质粒载体的性质 pDLI是pucl2的衍生质粒．古玉米黑粉菌热休 为遗传学研究的一种理想材料“_】。在国内外同类 克基因(h3970)的启动于和终止子．此外．还有两十 研究中．本研究首次成功地在玉米黑粉菌中建立了