麦芽酸性磷酸酶在乙醇变性时活力和构象变化的研究.pdfVIP

一 笙二壁全里墅撞些堂堂查婴堕垒笙壅堡 麦芽酸性磷酸酶在乙醇变性时活力与构象变化的研究 徐冬梅，刘厂深，刘维屏(浙江大学环境科学研究所杭州310029) 摘要：应用荧光光谮、紫外差光谱等技术研究了麦芽酸性磷酸酶经乙醇变性后活力与分子构象的变化情 况，结果表明，乙醇对酶活力及分子构象有显著影响。0～50％的乙醇使酶活力直线下降；变性后酶的紫 外羞光谱在213和234nm处出现正吸收峰，表明酶肽链发生变化；酶内源荧光强度随乙醇浓度的提离而增 强，酪氨酸、色氨酸残基微环境在乙醇作用下发生明显变化。 关键诃：酸性磷酸酶；乙醇；活磐：溶液构象 酸性磷酸酶广泛存在于生物界，从低等生物大肠杆菌、酵母到高等动植物组织、体液。 它能够催化磷酸单酯的水解及无机磷酸释放，是生物磷代谢的重要酶类ll～。不仅如此，酶 还是一种对周围环境变化相当敏感的生活物质，因此，专家们预测，将来对环境污染程度的 准确反应可能来自对酶等生物活性物质的检测13j。这使得酶在环境科学研究中的应用成为可 能。本文应用紫外差光谱和荧光光谱等检测手段，考察了麦芽酸性磷酸酶在不同浓度环境有 机物质．乙醇作用下构象与活力变化的信息，以期揭示麦芽酸性磷酸酶结构与功能的关系及 乙醇对其作用的分子机制。 1材料和方法 i．1试剂 溶解，对硝基苯磷酸二钠(PNPP)为AMRESCO产品，乙醇等其它试卉寸均为分析纯，水为 二次亚沸蒸馏水。 1．2酶的乙醇变性 变性体系含O．1mg／mL酶、O．1 mol／LpH5．5的NaAc．HAc缓冲液及一定浓度的乙醇，混 匀，20℃保温16小时，使酶达到稳定，测其构象变化。 1．3酶构象的检测 酶紫外差光谱在岛津uV．2401PC型紫外可见分光光度仪上进行，双光束，狭缝宽度 应浓度乙醇的缓冲液为参比，测得经乙醇处理的减去未经处理的酶紫外吸收光谱即为紫外差 光谱。酶荧光发射光谱在岛津RF．5301PC型荧光分光光度仪进行。激发波长280rim，激发 射光谱。 2结果与讨论 2．1 乙醇对酶活力的影响 麦芽酸性磷酸酶在0～50％乙醇中20℃保温16h， 然后测定酶的剩余活力，以正常酶活力为100％。酶活 力的测定方法是以PNPP为底物，反应总体积lmL，内 ‘4mm艄 含2mmol／LPNPP，0．Imol／LpH为5．5的NaAc．HAc缓 冲液，37℃反应20分钟后加2mL0．2mol／LNaOH终止 图l乙醇对醇件磷酸酶活力的影响 J。酶 反应，1二721型分光光度计400nm处测定吸光值【l 在不同浓度乙醇溶液中活力变化如图1所示，由图可见，经乙醇变性后酶活力真线下降，当 乙醇浓度达50％时，酶活力丧失了近～半。 2．2酶经乙醇微扰后的紫外差光谱的变化 391 —— 篁二壁全堕堑塑些堂兰查婴堕垒坠奎叁 图2为麦芽酸性磷酸酶经不同浓度乙醇(于0．I mol／L NaAc·HAc缓冲液，pH5．5，20。C)处理16h 后的紫外差光谱。由图可见，变性酶紫外差光谱分 别在213rim和234nm处出现强的和微弱的正吸收 峰，并且随乙醇浓度的增加，其峰值不断增大，但 吸收峰位基本不变。 2．3酶经乙醇微扰后的荧光发射光谱的变化 图2为经0，5％，10％，20％，30％，40％。50 图2酸性磷酸酶经乙醇变性后的紫外差光港 ％乙醇变性后酶的荧光发射光谱，由图可见，天然 酶内源荧光在344nm处有特征荧光发射峰，其强度 随乙醇浓度的上升而不断增强，当乙醇浓度达到50 ％时，荧光强度继续增强，但荧光发射峰位基本未 出现位移现象。 3讨论 溶液构象研究是从宏观上掌握磷酸酶整体结构 图3酸性磷酸酶经乙醇变性后的荧光发射光蔚 和了解磷酸酶在生理状态下发挥活性作用时的结构 状态的关键。紫外差光谱和荧光光谱可以利用蛋自质中芳香氨基酸的紫外吸收和荧光特性来 推测蛋白质的溶液构象，提供有关蛋白质生色基团的结构