由淀粉酶法生产海藻糖地研究(Ⅰ).pdfVIP

第二届全国发酵工程学术讨论会论文集 1998 由淀粉酶法生产海藻糖的研究∞ 朱利丹 毛忠贵 (无锡轻工大学生物工程学院无锅214036) 摘要从温泉土壤分离得7株菌，它们的胞内释放物能和淀粉反应生成海藻糖． 对其中的菌株WX-10·其内含物转化淀粉到海藻糖的途缝进行了视步验证，证 明其胞内含有将淀粉转化为海藻糖的酶系，MTSase和]VITHase。 关键词海藻糖，筛选，酶，生物台成 学科分类号Q939．97 海藻塘(Trehalose)是自然界分布较广的一种非还原性_双糖。早在1832年， Wiggers从黑麦的麦角中酋次提取出海藻糖．后来发现：海藻糖在自然界的动植 物和微生物体内广泛存在，尤其是在酵母，霉菌，蘑菇等真菌中．其含量高达干 基的15％以上。 大量的研究表明；某些物种对外界恶劣环境所表现出的抗逆耐受力和它们体 内的海藻糖有直接的关系．而外源的海藻糖对生物大分子同样有保护作用。由于 这一奇妙的生物特性，海藻糖在分子生物学，医药，食品。化妆品及其它领域得 到广泛的应用。 本世纪四十年代．欧美等国从面包酵母中抽提海藻糖取得成功．并建立了一 套用酒精抽提面包酵母，结晶分离海藻糖的方法．至今它仍然是海藻糖生产的主 要方法．在国内，中科院北京微生物研究所选育了一株高产海藻糖的面包酵母． 返姓面包酵母的培养收集．再提取海藻糖，取得了较大的进展．然雨，由面包酵 母提取海藻糖的最大局限是成本高，可供量少，在海藻糖最大需求晕的食品行业， 食品加工中添加海藻糖还是一种奢望。 海藻糖因受来源的限制．价格十分昂贵，在日本，通常为20000—30000日 元／Kg，而国内SIGMA级的海藻糖价格为8美元，g。 价格正成为实用化的关键所在。 当务之急是另辟捷径，开发海藻糖的工业化生产的途径．一度*起的用谷氨 以麦芽糖或蔗糖为主碳源，通过调节培养基的渗透压，在培养液中富集海藻糖的 发酵法。园转化率低，发酵液成分复杂，海藻糖的提取、精制困难而逐渐冷落下 来．1993年开始，海藻糖的研究在国际上形成热点。日本林原生化研究所在世 界上首次开发出从淀粉直接以极高得率生产海藻糖的技术，并申请了专利，在淀 粉糖工业史上掀起了一场革命。 本室由95年开始致力于以淀粉为原料酶法生产海藻糖的研究，取得了初步 的进展。 l材料和方法 1．1菌种筛选’ 1．1．1温泉土壤分离：采取温泉土壤。溶解于无菌生理盐水中．稀释后涂布于 高渗平板上，高温(50℃以上)培养4$hr后，挑选形态不同的菌落进行摇瓶培 养。 高渗固体培养基：麦芽糖0．2％；糊精0．1％；蛋白胨0．5％；牛肉膏o．2％； O．1％；Mgs040．05％；N8Cl5％以上；CaCI：0．1％； K2HPO．0．1％；NaH2POt 琼脂2％；毋17．2 ——269— 第二届全国发酵工程学术讨论会论文集 1998 摇瓶(产酶)培养基：麦芽糖2％；蛋白胨0．5％；牛肉膏0．1％；K2HPO‘ 0．1％：NaH2P040．1％；MgS040．05：pH7．2 1．1．2海藻糖生物合成‘：微生物经摇瓶培养基好气培养72hr后，培养液离心， 收集苗体．将菌体悬浮予20mMpH7．0的磷酸缓冲液中，甲苯破壁，再加入等体 积的10％的淀粉液化液(DE值=is)，40℃保温24hr后，糖化48hr． 1．1．3分析：用TLC定性分析上述反应液。HPLC定量分析． 1．2方法 I．2．1．菌体培养和收集：WX-10接入摇瓶培养基(同前)．28℃好气培养72hr： 菌体培养结束后，离心，收集菌体，再用生理盐水洗涤两次． 1．2．2海藻糖生物合成条件：5ml5％、DE20的淀粉液化液：5ml20mM， pH7．0的磷酸缓冲液，以上各反应物总体积10ml。静息细胞lg(湿重)，甲苯 0．2ml。35℃反应12ta．，水浴煮沸10分钟终止反应．取滤掖进行进行分析。 1．2．3分析方法；采用薄层层析’(TLC)和高效液相色谱(HPLC)分别进行 定性和定量分析。 (1)TLC条件；硅胶G薄板。展开剂为：正丁酵：毗叮：水(6：4：1)，显 色剂：20％的硫酸一甲醇溶液。 (2)}删Lc条件：柱子：APS，洗脱液：