pFASTBAC-THa系统表达IBV+SD株S1基因地研究.pdfVIP

±垦董笪量匿芏叁蔓童量壁垒差±煎芏茎盟堕金堡塞墨 SD株 用pFASTBAC—THa系统表达IBV S1基因的研究 刘兴友 李文刚 唐桂芬 (郑州牧业工程高等专科学校．郏州) 戴亚斌 (南京农业大学，南京) i|J尚高甘孟侯 (中国农业大学．北京。100004) 摘要将含IBvsD株s1基因的质粒PMDl 阳性．westernblot检测有90Kda大小的一条蛋白。 ， 、 ／关t调鸡传染性支气管炎s1基因序列重组、 I ， ‘ 除具有常用昆虫杆状病毒细胞表达系统的优点外，其最大特点是重组昆虫杆状病毒的全过程均在 细菌中进行，使重组简单快速。 1材料和方法 1．1 SalI BamHIHindIII 北京医科大学杜珩惠赠．sF9还由中国顼防医学科学院病毒所、及北京市农科院惠赠。 1．2 IBv M41鸡血清(一抗)．兔抗鸡酶标抗体(二抗)由中国农业大学实验动物所赵继勋教授惠 赠；lBvM41兔血清(一抗)由中国农业大学传病微生物教研室陈福勇教授惠赠。羊抗兔荧光抗体 由中国农业大学传染病微生物教研室苏敬良博士惠赠。羊抗兔酶标抗体(二抗)购自原平浩公司。 DG5a感受态细胞。 向，井按常规方法制备JMl09 1．4 常规方法将连接物转化DH5a感受态细胞，进行菌落筛选，采用快速DNA提取方法提取质粒 DNA，最后将提取的slpFAsTBAc、pFAsrBAc、对照DNA BamHI+PstI 泳，初步鉴定，取经初步鉴定的质粒用Pstl 定。 s1Bacmid 1．5按常规方法制备重组sD DNA并在sf9细胞中表达，收集转染细胞进行s1蛋白 检测。 1．6表达蛋白的检测 一86— 主垦童堑量匡芏垒耋童兰壁垒蔓±壅芏查煎盟量堡塞基 I．6．I免疫荧光检测取转染后传代至第3、4代的sf9细胞浓缩混悬液涂片，用火焰干燥}loo％ 冷丙酮．室温固定l PBs冲洗，再用自来水洗5min，最后用蒸馏水冲洗，火焰干燥；加工厂：500稀释的羊抗体(二抗)， 37℃湿盒感作30min，同前用蒸馏水，自来水冲洗．自然干燥，荧光显微镜检查结果。 1．6．2昆虫杆状病毒细胞表达的sl蛋白的sDs—PAGE电泳检测将感染后72h的sf9细胞收 sDs—PAGE上样液裂解细胞95℃煮沸 集浓缩，用PBs洗一捷，每瓶细胞收集的沉淀细晦用200ul 10min，按常规方法制备浓缩胶和15％的分离胶，在相应孔中分别加入低分子蛋白参照标准loul． 样品20u1。20～25mA电泳2～3h，再按常规方法进行染色和脱色。 1．6．3westernfblot检测 按常规方法进行，以明胶封闭PVDF膜，与一抗和二抗作用，然后用 4一氰一1一萘酚显色。 2结果 2．1 sDslpMDl8一T中s1基固的方向用PstI酶切后，经电泳，在1100～1200bp间有一条带， 另一条带位于3000bp之后，表明sDslpMDl8一T中的s1基因为5端至3端正向连接。 2．2 sDsl bp、4300bp、 pFASTBAc—HTa的鉴定结果电泳后见有三条带，其大小分位于3300 I酶切后在1100～ pFAsTBAc—HTa为最大，均为预定的大小。sDslpFA