巢式甲基化特异性PCR检测p16基因地研究.pdfVIP

·101· 巢式甲基化特异性PCR检测p16基因的研究 张华府伟灵黄庆郛颖 在结直肠癌发生发展过程中，癌相关基因的遗传变异，包 (yrGGGGAGGAGlnAGl’I丁) 括DNA序列的重组、碱基置换、缺失和插入等在由正常细胞 向癌细胞的转变过程中起着重要作用。但由非遗传变异所引 上，退火温度为55℃。以第1轮PCR反应产物为模板，进行 起的癌基因和抑癌基因表达异常也同样起重要作用。DNAMSP扩增(同前)。5．统计学分析：各组p16甲基化发生率的 甲基化异常是典型的非遗传变异之一。我们采用甲基化特异 差异显著性采用两样本率的f检验。 二、结果 性PCR(MsP)及巢式甲基化特异性PCR技术，检测了结直肠 癌患者肿瘤组织中DNA p16基因的异常甲基化情况，比较 1．MSP方法检测结果：在53例肿瘤标本中。有24例 MSP及巢式甲基化特异性PCR两方法的灵敏度，探讨p16基 因异常改变作为结直肠癌临床辅助诊断分子生物学标志物的 分期中，A、B期与C、D期p16基因甲基化的阳性率存在显 可能性。 著性差异(P0．05)。结果见表1。 一、材料与方法 表1直肠癌患者p16基因甲基化检测结采(MSP方法) 1．临床标本收集：肿瘤组织标本取自第三军医大学西南 医院及贵州省人民医院普外科2004年5月至2004年12月 收治的结直肠癌住院患者，均经病理学诊断证实。手术中收 集相应的肿瘤组织标本，一踟℃保存。10例正常人均为第 三军医大学西南医院体检合格的献血人员。抽取抗凝外周血 注：与c、D组比较，*P0．05； 5Inl，并分离收集血浆，一80℃保存。 2．巢式MSP方法检测结果：在53例肿瘤标本中，有38 例(71．7％)标本检测出p16基因启动子区甲基化。且在 2．结直肠癌细胞株的培养：结直肠癌细胞株HCTll6为 本科保存的细胞株，SW480细胞株由西南医院消化科张汝刚 博士惠赠。两种细胞分别培养于含10％小牛血清的5A在显著性差异(P0．05)。结果见表2。 Medium和RPMI 裹2结直肠癌患者p16基因 1640培养基中，予37℃，含5％002的温箱 中孵育。 甲基化检测结果(巢式MSP方法) 3．DNA提取：血浆DNA的分离使用试剂盒QIAamp Blood Kit(Qiagen，德国)。培养细胞DNA的提取使用试剂 盒E．N．Z．ABlood磁t(ol姚，美国)。肿瘤组织DNA的 tissue 提取使用试剂盒QIAAmpKit(Qiagen，德国)。 注：与D组比较，*P0．05； 4．p16基因异常甲基化检测：(1)亚硫酸氢钠修饰基因组 DNA 3．两方法灵敏度比较：由表1和表2可知，巢式M即的 DNA：使用试剂盒ENMethylation瞄t(ZYMO，美国)； 灵敏度较普通的MSP技术有明显提高。经过巢式MSP2次 (2)引物设计：设计两对引物，一对为甲基化特异的(p16MF 和p16MR)，另一对为非甲基化特异的(p16UF和p16UR)。 53)提高到了71．7％(38／53，P0．01)。 p16MF：TTATTAGAGGGa、(；()GGC(K玉≮rCGC 三、讨论 p16MR：GACCCOGAAOCGCGACOGTAA：p16UF： CAA(X：G 结直肠癌是一常见的恶性肿瘤，在西方发达国家其发病