SARS-CoV+S蛋白受体结合区免疫原性与其抗体的免疫保护性研究.pdfVIP

Ii !!!!堡i!室些匡堑堑壁鲨主盒丝塞堑塑：：盔盒垄直 SARS—CoV s蛋白受体结合区免疫原性 及其抗体的免疫保护性研究 沈成利。z周育森：吴昊1 1．首都医科大学附属北京佑安医院；2．军事医学科学院微生物流行病所 其中774例死亡，给公共健康带来了巨大的威胁。目前尚无特效预防及治疗的药物。开发研制安全、有效的疫 苗仍然是防治该病的有效措施。 SARS—CoV S蛋白是体液免疫和细胞免疫反应作用的主要靶点，存病毒感染中发挥重要的作用。S蛋白介 导病毒吸附到细胞表面受体，而且诱发病毒和细胞膜的融合，是病毒感染致病相关的主要蛋白。与免疫保护有 关的中和保护性抗原表位主要分布在该蛋白上，是发展疫苗和被动免疫制剂的最主要靶蛋白。 Fc段(人的抗体 研究用293T细胞表达s蛋白的受体结合区(RBD，s蛋白的第318～510位氨基酸)与人IgGl 恒定区)相连的融合蛋白。用该蛋白免疫新西兰大白兔和恒河猴，用免疫后动物的血清进行中和试验，观察血 免疫保护中的作用，为疫苗的发展、免疫防护及免疫致病机制的研究提供基础资料。 材料和方法 一、试验材料 (一)质粒及细胞 人IgGl 实构建、保存。 (二)试验试剂 DMEM培养基、胎牛血清购[目Gibco／BRL公司。 弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂及氢氧化铝佐剂 羊抗兔IgG—HRP，鼠抗猴IgG—HRP。 购自北京中山生物技术有限公司。 (三)试验用动物 新西兰大白兔雌性2只，12周龄，体重分别是2．8，3．0公斤： 恒河猴4只均为雄性，1．5～2．ON岁，体重2．3～2．6公斤； 均购白军事医学科学院动物所。 二、试验方法 (一)重组RBD—Fc蛋白 编码193个氨基酸片段的SARS—CoV Fc区融 4FF Sephar。se 纯化。 (二)新西兰大白兔的免疫 纯化的150u g 6l !!!!篁!!塞丝呈墼壅璧鲨堡垒篁兰!三塑=奎叁茎童 次免疫加强后lO天的血清，在4C储存备用。 (二)恒河猴免疫 ．㈣500ug 时，免疫四只恒河猴。间隔3周加强一次，共加强免疫四次收集免疫前血清及每次免疫加强后10天的血清，在 4℃储存备用。 (四)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测 u 免疫后兔及猴血清使用ELIsA的方法进行检测。用0．1舶q碳酸盐作包被液，1 37(2孵 ℃孵育id,时，洗板5次，用含0．I％删PBS洗板5次，加入辣根过氧化酶表记的羊抗兔或鼠抗猴IgG 对照均数乘2．1倍标为阳性。 (五)SARS冠状病毒感染的中和试验 No． 采用固定病毒稀释血清法：将200TCID50(50％组织培养感染剂量)SARS--COY 胞密度调节N3×105／ml，每孔1 清最高稀释度孔，为该血清的中和抗体滴度。 结果