白喉毒素A基因表达载体pEGFP-N1-DTA的构建与功能验证.pdfVIP

中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十六届学术研讨会论文集 白喉毒素A基因表达载体pEGFP-N1-DTA的构建及功能验证 张景锋，卫恒习，李莉，张守全 (华南农业大学动物科学学院，广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室，广州 510642) 引言 Toxin,DT)是由感染13噬菌体基因组的白喉棒状杆菌所产生的分子 白喉毒素(Diphtheria toxin 量为58 A。 kD的外毒素，经胰蛋白酶水解分成193个氨基酸残基的A片段(diphtheria B,DTB)。DTA分子量为22kD，位于白 DTA)和342个氨基酸残基的B片段(diphtheriatoxin 喉毒素氨基末端，是毒素活性基团，它在细胞内可以催化ADP．核糖基化，灭活真核细胞的延 长因子II(EF．II)；DTB分子量为38kD，位于羧基末端，由跨膜、转位、受体结合区组成， 负责白喉毒素与细胞表面受体的黏附并把DTA导入细胞内[1．2]。有研究表明，DTA的毒性 极大，细胞内一分子DTA表达的毒蛋白足以杀死细胞，而且，细胞死亡后释放出的毒蛋白由 究了DTA表达对细胞EGFP蛋白表达以及细胞增殖的影响，为肿瘤治疗和小鼠模型建立等研 究提供了实验依据。 材料与方法 ID：2650491)， 从NCBI数据库查询并获得白喉毒素蛋白的前体tox的氨基酸序列(Gene 截取其编码序列上游的600bp序列，人工合成该序列。并将合成的DTA序列克隆到pEGFP-N1 观察EGFP和DTA两个基因的表达情况以及293T细胞的增殖情况。 结果 本实验成功构建了pEGFP-N1．DTA重组载体。且在细胞转染实验中，实验组细胞检测到 DTA的表达，而在pEGFP-N1对照组和空白对照组均未检测到DTA的表达。同时，在荧光 达，而实验组EGFP表达水平极低，表明DTA蛋白在293T细胞中的表达抑制了EGFP荧光 蛋白的表达。该实验证明了DTA蛋自的表达抑制了细胞内蛋白的表达。利用MTT法证明了 细胞内DTA蛋白的表达对细胞有杀伤作用，显著地影响了细胞的增殖。 讨论 DTA蛋白毒性极大，一分子的白喉毒索足以杀死细胞[3】。鉴于其对细胞的巨大杀伤作用， 近年来，白喉毒素被广泛用于肿瘤的基因治疗以及疾病动物模型的建立。本研究成功构建了 DTA基因表达载体，并对其功能进行了验证。结果显示，白喉毒素能抑制细胞内蛋白的表达， 对细胞有杀伤作用，从而影响细胞的增殖。本研究比较直观地验证了DTA基因的表达对细胞 内蛋白质合成的抑制以及对细胞增殖的影响，为以后的研究者提供了理论支持。相信伴随着 等报道，白喉毒素对肺癌细胞的杀伤作用，不仅通过抑制蛋白质的合成，可能还与诱导细胞 凋亡有关。本实验未针对该问题进行研究，今后有待进一步的探讨。 参考文献 toxin．AnnRev Biochem．1977，46：69-94． 【1】PappenheimerA．M．Diphtheria toxin：modeofactionand Rev1975．39：54-85． [2】CollierR．J．Diphtheria structure．Bacteriol a1．Onemoleculeof toxin A E，et 【3】YamaizumiM，MekadaE，Uchida diphtheriafragment introducedintoacellcankillthecell．Celll978．15：245-250．