咪唑立宾产生菌的选育与其发酵的初步研究.pdfVIP

眯唑立宾产生菌的选育及其发酵的初步研究 李业英董悦生刘梅崔晓兰路新华张华贺建功 (华北制药集团新药研究开发中心国家为生物工程中心石家庄) brefeldianum 的培养滤液中分离而得的一种咪唑核苷类抗生素，分子式为C9H13N306。它是一种嘌呤核苷合成 抑制剂，能特异性地抑制快速增长的淋巴细胞、如T细胞、B细胞的分裂和增殖，从而产生免疫 抑制作用。作为免疫抑制剂，1991年12月起在日本临床肾移植中应用。 近年来在临床上除用于抑制肾移植时的排斥反应外，同时也可用于治疗狼疮性肾炎、类风湿性关 节炎及肾病综合征等自身免疫性疾病。 以从土壤中筛选得到的能够产生咪唑立宾的丝状真菌作为野生出发菌株，经菌种鉴定为正 发酵单位，首先对其进行了自然选育的研究。通过对野生菌株进行自然选育，得到两株发酵单 位明显提高的菌株MZ一1—4和MZ．1．6，发酵单位分别达到出发菌株的308％和336％。接着以 MZ—l一6作为出发菌株，在初始发酵配方的基础上，采用L9(34)的正交实验对其最佳发酵培养基 进行了初步探索。通过对结果进行直观分析得到了各主要培养基成分的最佳配比。在该配方下 MZ．1．6的发酵单位提高了121％。随后又对MZ．1．6进行了紫外诱变育种的研究，经过诱变选 育，得到了菌株MZ-2．43，其发酵单位是MZ一1—6的2．75倍。最后应用均匀实验设计软件，以 工业化原材料替代实验室原材料，对MZ一2-43的最佳培养基组分进行了探索，得到了该菌株的 最适发酵培养基，在此配方下，其发酵单位又进一步提高了22．2％。 总之，经过一系列的菌种选育和发酵培养基的研究，最终获得了菌株MZ．2．43，在其最佳 发酵培养基中，咪唑立宾的发酵单位提高到了野生出发菌株的10．3倍，初步具备了产业化的潜力。 关键词：咪唑立宾；自然分离；诱变；正交及均匀设计； 中图分类号：Q933 文章标识码：A brefeldianum的 培养滤液中分离而得的一种咪唑核苷类抗生素，其化学名为5．羟基．1．B．呋喃糖基一lH咪唑．4．羧 酰胺，为白色或微带黄色的结晶粉末，无臭，在水或二甲亚砜中易溶，在甲醇、乙醇或氯仿中几乎不 溶，分子式为C9H13N306，熔点约为198℃。 咪唑立宾是一种嘌呤核苷合成抑制剂，能特异性地抑制快速增长的淋巴细胞、如T细胞、B 细胞的分裂和增殖，从而产生免疫抑制作用。作为免疫抑制剂，1991年12月起在日本临床肾移 植中应用。日本许多I临床移植中心已将咪唑立宾作为肾移植后的常规免疫抑制药物。我国近年 来也将其作为肾移植抗排斥药用于临床。咪唑立宾同时也可用于治疗狼疮性肾炎、类风湿性关 节炎及肾病综合征等自身免疫性疾病。 215 1材料和方法 1．I藏种 本实验室献±壤孛筛选褥刘的野生菌株，经鉴定秀Eupenicillum．sp。 1．2培养基及培养条件 斜面、平扳培养基：PDA培弊基。 种子培养基(％)；淀耪2，楚饕糖|，燕榨黄姜镌粉0，2，麦芽耪0．6，酵母粉0。3，NaCl 7．0。 0．2，MgS04·71-120，CaC030．2，pH 发酵培养基(％)：淀粉l，葡萄糖2，热榨黄豆饼粉1．3，麦芽粉O．8，酵母粉O．4，NaCl 0。13，CaC03 0，2，滞7．0a 培养条件：取保藏予．鼬℃豁冷冻管遣子滚，接摊子PDA斜磋，26℃培莽宠蒇屠，挖袭法接 间48h。发酵时间为120h。接种蠼为3％。 l，3藿株蘸垂然分离 用无菌铲挖取Icm2左右的培养好的新鲜斜磷，加入到含膏玻璃珠及20mL爱理盐水的三兔 瓶中。将三角瓶溉于摇床上220r／rain振荡30min，打散。振荡宛成后，用滤纸过滤，滤液作梯 发耩释涂援，筠℃培莽6天。培莽完藏嚣麸适合豹稽释梯度下豹平板上挑取单菌落，进行发酵， 耀HPLC测定效价。 1．4检测 测定效徐。 1．5紫外诱交 紫外线波长2．36X 余步骤基本霹蘩辣翡耋然分离。调整滤滚孢予浓度后，吸取4mL至子壹径9cm豹薏蓥培养魁 中进行诱交。 1,6发酵培养基