猪源致病性沙门氏菌耐药基因的检测的研究.pdfVIP

获奖论文 3 猪源致病性沙门氏茵耐药基因的检测研究4 马孟根r，王红宁∥，余勇3，李成忠2，张东3，羊云飞2，王泽洲3，刘世贵1 1．四川大学生命科学学院，成都，四川，610064；2．四川农业大学动物科技学院， 雅安，四川，625014；3．四川省动物防疫监督总站，成都，四川，610041 摘要：采用平板稀释法(NCCLS2003)，对30株猪源致病性沙门氏菌进行了药敏试验，结果是30株菌对五大类 抗生素(氨基糖甙类、四环素类、氯霉素类、p内酰胺类和磺胺类)的13种药物的耐药率以四环素类最高(四环索83．3％ 和强力霉素80％)，磺胺类次之(磺胺甲基异恶唑80％和复方新诺明76．7％)，头孢类最低(头孢氨苄10％和头孢噻吩 13．3％)。设计了15对引物，对耐药基因进行了扩增及序列测定。采用PCR技术，对30株猪源致病性沙门氏菌的耐 性(88％)。 关键词：沙门氏茵；耐药基因；检测 自20世纪20年代末青霉素发现后，相继有很多抗生索以及磺胺类药物被发现。据报道抗生素的 发现和应用使人的平均寿命延长了15年以上。在抗生素发现和应用的早期，几乎所有的细菌性感染 疾病都很容易治愈。但是随着抗菌药物的广泛应用，细菌的耐药性很快出现，尤其是在畜牧业养殖中， 为防治疾病感染、促进动物生长，大量的抗生素被应用于饲料中，使得细菌的耐药性更为严重和广泛。 细菌的耐药已严重威胁着人和动物的健康，13益受到人们的重视。 在猪沙门氏菌耐药性的研究方面，国外研究得比较深人¨．2j，而我国大都停留在表型上，对其分子 机理及耐药基因的研究很少，且不系统和全面引3。本研究设计了15对引物，对氨基糖甙类、四环素类、 氯霉素类、p内酰胺类和磺胺类五大类的耐药基因进行了扩增，建立了耐药基因的PCR检测方法，对 30株猪源致病性沙门氏菌进行了检测。 _l材料和方法 1．1 主要试剂 DNA I ladder购自华美生物工程公司，入一EcoTl4 taq酶、dNTP购自上海生物工程有限公司，100bp franmentDNA Marker购自宝生物(大连)有限公司。 1．2菌株及质粒 菌标准株C，9一，，购自中国兽药监察所。试验中所用到的其他沙门氏菌菌株由四川农业大学动物预防 医学生物工程实验室提供。 1．3供试药物 链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、四环素、强力霉素、磺胺甲基异恶唑、复方新诺明、氯霉素、青 *资助项目：国家“十五”重点科技攻关子课题(2002BA514A一12—5)。 **作者简介：马孟根(1974一)，男，四川仁寿人，博士，主要从事动物细菌性传染病分子生物学研究。 *--通讯作者：王红宁，女，教授、博士生导师，主要从事裔禽传染瘸、徽生物生鳜置穗的磅究。 4 2005学术年会 霉素G、氨苄西林、头孢氨苄购自中国兽医药品监察所。 1．4药敏试验 以大肠杆菌ATCC 沙门氏菌对以上供试药物的MIC值。具体方法及判定标准参见文献[4。。 1．5耐药基因的PCR扩增、测序 根据Genbank中的基因序列，并参照相关的文献[2,3j，采用DNAStarPrimerSelect软件设计弓|物， 由上海生物工程有限公司合成。 表l引物序列及相关信息 Buffer 25mmol／L 反应体系：10×PCR 5ttl，MgCl2 (10弘mol／L)各4．5tA，模板3一，taq 52℃30s， 反应条件：95。C预变性10min；94℃变性30s，退火温度为：Sull一251℃30s，Sul3 aph(3’)一II、aadAl、aae(3)一Ia、tetC、catl、CmlA 55oC 30s，F10r、16SrRNA(对照)56℃30s，aadB 对PCR阳性产物进行序列测定(由上海生物工程有限公司完成)、分析。 2结果 2．1 30株猪源性沙门氏