50L规模中试发酵重组核苷二磷酸激酶A工程菌.pdfVIP

50L规模中试发酵重组核苷二磷酸激酶A工程菌 熊盛L扣钱垂文“2黄立2刘秋英2张美英2王一飞2 (1暨南大学药学院制药工程教研室，2暨南大学生物医药研究开发基地，广州510630) 中进行补料分批培养，所得茵体经过高压匀浆后，微滤去除茵体残渣，所得样品超滤浓缩后经离子 交换层析和亲和层析两步纯化得重组蛋白制品．结果表明，50L培养液经过lOh培养后，湿茵收量 为31．27 纯补加碳源相比，同时补加碳源和氮源可以显著提高茵体产量，但对目的蛋白表达量地提高不明显． 奠定了物质基础． 关键词：核苷二磷酸激酶DNA重组中试发酵纯化 中图分类号：Q786 文献标识码：A 重组DNA技术和细胞大规模培养技术的结合使大量生产那些难以从天然途径获得的蛋白质成 为可能1wJ。由于大肠杆菌易于操作，遗传背景清楚，发酵成本低。至今仍是重组蛋白的首选体系。 它极适于表达干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、生长因子、生长素、人血清白蛋白等分子较小、 空间结构较简单，并且不需翻译后修饰的蛋白质[41。在获得了合适的表达系统后，可以从两方面来 提高重组蛋白的产量：一是提高单个细胞的蛋白产量；二是提高发酵液的细胞密度。目前，已有多 culUu屯，HCDC)用于重组或非重组大肠杆菌的发酵生产【卯。应 种高密度培养技术(highcell-density 用HCDC，·．不仅可以成倍提高蛋白产量，还可以降低培养液体积、简化下游处理、减少废水，从而 降低产品成本及设备投资。另外，某些类型的大肠杆菌表达载体的蛋白表达量有限，只能通过提高 细胞密度来提高发酵产量。如：分泌型表达载体，它克服了大肠杆菌表达系统的局限性，可以用来 表达抗体等空间结构复杂的蛋白质，但分泌型载体的细胞表达量极低，一般只占菌体总蛋白的0．3 4％。 在Ecoli高密度培养工艺中，最常用的是补料分批培养(fed．batch 用于重组或非重组Ecoil可得50 g(DCW)／L的细胞密度【6】。HCDC技术的发展，使得这一数值不断 提高，接近200 长抑制性副产物形成、热释放限制等fsJ。 a 本课题组在前期工作中，已经构建了能高效表达人NDPK-A的工程菌EcoliDH5 coli DH5 Q【pBV-nm23H1]的发酵和纯化工艺． 1 材料和方法 1．1 材料 ‘基金项目：国家十五863项目(200lAA215041)；国家自然科学基金(No；广东省自然科学基金团队项目 (No．2004E039213)通讯作者，电子邮箱：xiongshen999@,263．net 294 1．1．1 菌株和质粒E．coliDH5 a购自Promega公司，基冈型为：F一由80dlacZ厶M15厶 endAlrecAl thi-l relAl。Nm23一剧 hsdRl7(rK·mK+)deoRsupE44入‘gyrA96 (IacZYA-argF)U169 基网cDNA由中国医学科学院基础医学研究所张金三教授惠赠，表达载体pBV220由中国预防医学 科学院病毒学研究所张智清、侯云德教授惠赠。表达质粒pBV-Nm23HI由本室候字等构建并保存， coliDH5 pBV-Nm23Hl转化Ea得：f=程菌DH[pBV-Nm23]。 1．1．2 主要试剂胰化蛋白胨(bacto-t叮ptone)及酵母提取物(bacto-yeast Base、SDS、丙稀酰胺、N-N’-亚甲 公司；IPTG、氨苄青霉素、卡那霉素、Agarose、Glycine、Tits 基双丙稀酰胺等均购白Promega公司：考马斯亮蓝G．250、R．250等染料购自华美生物：亡程公司： 购自上海丽珠东风生物技术公司：其余试剂为国产或进