抗犬细小病毒卵黄抗体制备与临床应用初探.pdfVIP

抗犬细小病毒卵黄抗体制备与临床应用初探 朱向红1 齐红燕1 汪毅2 (1．上海金山区农产品检测中心，上海201500．； 2．上海交通大学农业与生物学院，上海201101) 摘要：本试验采集CPV病料，提纯病毒，制成强化油乳剂疫苗，免疫经产母鸡，免疫卵中含有高 滴度的抗CPV血凝抑制抗体。经苯酚液初提和硫酸铵盐析，5ml卵黄混合液可得IgY26．37mg。制 备的抗CPVIgY卵黄抗体口服制剂安全可靠，临床治疗82例CPV感染病例，治愈74例，治愈率达 90．24％，对3月龄以内发病早期病犬治愈率高达95．23％。 关键词：犬细小病毒；卵黄抗体；口服制剂 犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)感染是犬最常见的传染病之一，其发病率与死 亡率高达50％～100％，严重影响犬的健康。近年来，随着城乡宠物犬和肉用犬饲养数 量的增加，该病的发病率呈上升趋势。目前对患病犬一般采用对症和支持治疗，治愈率 很低，尤其是对2～3月龄幼犬效果更差。有报道用犬和异种动物驴等制作抗病毒血 清H、2j，将提纯的抗CPV的血清球蛋白注射液用于治疗患病犬，取得了一定的效果。 深入。目前在IgY的形成、生物学特性等方面取得较大的进展旧。，并且IgY作为诊断 试剂和防治药物的研究愈来愈受到关注。近年来国外已制备了针对不同抗原的IgY， 如轮状病毒、流感病毒、大肠杆菌、人胰岛素、人大肠杆菌等Hj。IgY具有产量高，价格 低廉，不会产生抗药性等突出优点，有着广泛的开发前景。 本试验从临床确诊为CPV感染的病死犬中采集病料，经病毒提纯后制成强化油 乳剂苗免疫经产母鸡，从免疫卵中提纯IgY制成口服制剂，并对临床上CPV感染犬进 行口服治疗试验。 1材料与方法 1．1免疫卵制备 1．1．1 CPV疫苗制备采集临床上用CPV免疫金试纸条(市售，上海产)检测为 阳性的病死犬的肠道及内容物按重量1：1加无菌生理盐水研磨，离心去沉渣，上清 ．269． 的10％加入洗涤后的戊二醛化猪红细胞，摇匀4。C放置2h，离心取沉淀，用4％的盐水 售的CPV标准阳性血清做血凝抑制试验(HI)进行验证，取上述病毒液经甲醛灭活后 加入褐藻多糖(上海水产研究所提供，针剂50mg／m1)使每ml液体含4mg，制备成强化 油乳剂疫苗。 1．1．2免疫将制备的CPV强化疫苗免疫40周龄罗曼蛋鸡，笼养，产蛋率80％ 以上。免疫剂量每头份肌注0．5ml，间隔10d进行第二次免疫，免疫剂量为1ml。免疫 14d后，对采取血样与卵黄提取IgY进行HI效价测定，当效价达1：256以上时收集免 疫卵，效价低于1：128时进行第三次免疫，免疫剂量为lml，14d后收集免疫卵。 1．2 IgY的提取 1．2．1水稀释法：在无菌条件下取卵黄混合液50ml，加人pH7．0无菌水250ml， 充分混合均匀，制成1：5稀释的卵黄水溶液。试验分4组，每组取上述卵黄稀释液 心20min，过滤取上清。试验4组：用HCl调节pH至4．4，按总量0．5％加入羟丙基甲 基纤维素(HPMC)，放在冰箱一40℃冻融2次，离心20rain，过滤取上清。 1．2．2有机溶剂抽提法 取1：5稀释的卵黄水溶液30m]，按3：l加入氯仿 10ml，充分振摇，在室温放置20min，4。C3000rpm离心20rain，过滤取水相。 入PEG，充分振摇，4℃3000rpm离心20min，取沉淀。 1．2．4苯酚法取1：5稀释的卵黄水溶液30ml，再按照1：1的比例加入4％苯 酚液30ml，充分振摇，然后4℃3000rpm离心20min，过滤取上清。 1．3 igr提纯与口服制剂制备 1．3．1 IgY提纯采用饱和硫酸铵法。第一次提纯用50％饱和度，第二次用 33％饱和度。提纯的IgY溶入少量无菌水中，放人透析袋中流水透析除盐。利用紫外 分光光度计测定抗体含量。 1．3．2 IgY口服制剂制备将提纯测定含量后的IgY用无菌水配制成2mg／Ⅱd， 封装在安培瓶中，每瓶6ml，放入65。C水浴箱中20min进行处理。待冷却后取样进行 口服安全性试验、HI效价测定及细菌学检验。合格后即为抗CPV卵黄抗体El服制 ．270． 剂。 1．3．3 VI服制剂安