青霉素酶特异性抗血清间接ELISA方法的建立.pdfVIP

动物医学进展。2010，31(9)：47—50 in Medicine ProgressVeterinary 青霉素酶特异性抗血清间接ELISA方法的建立 严 兵，彭开松，薛秀恒，涂 健，王 强，何东旭，祁克宗。 (安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥230036) 摘 要：以青霉素酶为抗原，免疫健康獭兔，自行制备青霉素酶特异性抗血清(PcAb)，并建立间接酶联 免疫吸附试验(ELISA)的测定方法，优化试验条件，测定制备的青霉素酶特异性抗血清效价。结果表面抗原 最佳包被浓度为10 000，阳性血清最佳稀释度为l：2000，抗原最佳包 tlg／mL，酶标二抗最佳稀释度为l：2 被条件为4℃过夜，血清最佳反应时间为37℃1h，酶标二抗反应最佳时间为37℃1h，与底物作用的最佳 时间为20min。 关键词：青霉素酶；抗血清；间接ELISA 中图分类号：s859．796 文献标识码：A 物工程公司产品；TMB购自上海生工生物工程技术 8-内酰胺酶(p-lactamase)是一类由细菌产生的 能够降解8一内酰胺类抗生素，使其抗菌作用减弱或 服务有限公司；其他包被液、抗体稀释液、底物液、终 消失的酶，是由多种酶组成的酶家族，俗称抗生素分 止液、封闭液均由安徽农业大学动物科技学院动物 解剂，又名解抗剂或金玉兰酶制剂[1屯]。至今发现的 病理实验室自制。 8一内酰胺酶的数量已超过190多种，主要为青霉素1．1．3仪器318MC型酶标仪为上海市三科仪器 酶和头孢菌素酶[3]。 公司产品；SZ-1型快速混匀器为江苏省金坛市金城 青霉素作为B一内酰胺类药物是治疗奶牛乳腺炎 国胜实验仪器厂产品；96孔ELISA酶标板为浙江 的首选药物，是牛奶中最常见的残留抗生素。国内 省台州市爱思进公司产品；SZ一1型快速混匀器为江 大多数乳品企业出于经济利益的驱动，利用青霉素 苏省金坛市金城国胜实验仪器厂产品。 酶能选择性分解牛奶中残留的青霉素类抗生素的特 1．2方法 性，人为的添加青霉素酶而达到降低牛奶中青霉素 1．2．1 青霉素酶特异性抗血清的制备 mL弗 类抗生素的含量，生产人造“无抗奶”，但是由于该制 1．2．1．1制备青霉素酶佐剂苗免疫前将10 mL 剂的安全风险未知，为国家禁止使用的食品添加剂， 氏完全佐剂和10mL青霉素酶分别吸人两个10 目前国际和国内均不允许该酶在牛奶中作为添加剂 注射器内，然后插入三通管内，交替推动针管、混匀， 使用[4]。另一方面，B一内酰胺酶的滥用也助长了牛反复搅拌，直至形成黏稠的乳剂，滴于水上完全不扩 奶生产中8一内酰胺类抗生素的滥用，加速了耐药菌 散为止。 的传播，严重威胁人体健康和中国奶业的长期发 1．2．1．2免疫动物 选择12只、3月龄左右、健 展睁7|。因此，本研究建立的青霉素酶特异性抗血清 康、雄性、体重(2．0±0．5)kg的獭兔，随机分为A、 B、C3组，每组4只。试验前进行健康观察和预饲 间接ELISA检测方法，对于我国奶制品安全监测及 保障我国奶业健康发展意义非常重大。 养2周，免疫之前心脏采血，作为阴性血清对照。用 1材料与方法 上述制备的青霉素酶佐剂苗进行背部皮下多点免 疫，首免用青霉素酶弗氏完全佐剂苗，加强免疫用青 1．1材料 霉素酶弗氏不完全佐剂苗，每两周免疫1次，每次免 1．1．1 实验动物 12只3月龄左右健康獭兔。