LKB1（Thr336）磷酸化多克隆抗体的制备及其应用.pdfVIP

中国生物制品学杂志2008年 11月第2l卷第 11期 ChinJBioIogicalsNovember2008，Vo1．21No．1l · 995 - 中国图书分类号 R392．33 文献标识码 A 文章编号 1004—5503(2008)I1·o995O·5 【诊断制品 】 LKB1(Thr336)磷酸化多克隆抗体的制备及其应用 任艳敏 黄蓓 魏浩 赖柳静 【摘要 】 目的 制备LKB1(Thr336)磷酸化多克隆抗体，并以其检测细胞中LKB1的表达。方法 用生物信息学方法选取 LKB1Thr336位点附近 1O个氨基酸，且使Thr336位点磷酸化 ，并铰链到 BSA上。以此为抗原免疫家兔，制备抗血清，纯化后通 过ELISA法检测抗体效价 ，Westernblot法检测抗体特异性 ，并用 LKB1抗体和p-LKB1(Thr336)抗体分别检测正常细胞及肿瘤 细胞中LKBl的表达。结果 纯化后的p-LKB1(Thr336)抗体效价为 1：1000；LKB1抗体不仅识别His—LKB1蛋白，而且识别P— LKB1(Thr336)抗原，而p-LKB1(Thr336)抗体仅识别 p-LKB1(Thr336)抗原 ；在正常细胞 HL7702和 HEK293中，LKB1表达较多， 而在 HeLa细胞中，LKB1基本没有表达；在这 3种细胞中，p-LKB1(Thr336)基本没有表达；在肿瘤细胞S180、COS．7和Caco2中， LKB1和P—LKB1(Thr336)均有表达 ，p-LKB1表达相对较多。结论 已制备了特异性的P—LKB1(Thr336)多克隆抗体，LKB1一 Thr336位点的磷酸化可能是某些肿瘤发生的特征 ，有望成为肿瘤诊断的指标之一。 【关键词】 LKB1(Thr336)；磷酸化；多克隆抗体；生物信息学；肿瘤细胞 PreparationandApplicationofPhosphorylatedLKB1(Thr336)PolyclonalAn— tibody RENYan-rain，HUANGBei，WEIHao，etal(SchoolofL Sciences，AnhuiUniversity，Hefei230039，China) A【bstract】 Objective TopreparephosphorylatedLKB1(Thr336)polyclonalantibodyfordeterminationofexpressedLKB1 invariouscells．Methods TheThratsite336 (Thr336)ofLKB1wasphosporylatedandtheneighboring10aminoacidswerecho- sentohingeonBSA bybioinfomr aticmethods．Theconstructedpeptidewasusedasanantigentoimmunizerabbits，andtheantisera waspurifiedthendeterminedofrtiterbyELISA andforspecificitybyWesternblot．Detemr inetheexpressionsofLKB1innomr aland tumorcellswithpreparedp-LKBl(Thr336)antibody，usingLKB1antibodyascontro1．Results Thepurifiedp-LKB1(Thr336)an- tibodyreachedatiterof1：1000．LKB1antibodyrecognizednotonlyHis—LKB1protein，butalsop-LKB1 (Thr336)antigen． However．p-LKB1(Thr336)antibodyrecognizedonlyp-LKB1(Thr336)antigen．LKB1showedhighexpressionsinHL7702and HEK293cellswhilefewexpressioninHeLacells．However，fewexpressionofp-LKB1(Thr336)wasobservedinthe3kindsofcells． BothLKB1andp-LKB1(Thr336)wereexpressedinS180，COS一7andCaco2cells，ofwhichtheexpressionlevelofp-LKB1 (Thr336)w