烟草和水稻中水稻条斑病菌过敏反应激发子Ssb_x互作因子的鉴定.pdfVIP

中国农业科学 2015，48(4)：683．694 SeientiaAgriculturaSiniea doi：10 ． 38648．issn．0578-1752．2015．04．06 烟草和水稻中水稻条斑病菌过敏反应激发子 Ssbx互作因子的鉴定 孙玉静，马文秀，蔡璐璐，刘 良，邹丽芳，陈功友 (上海交通大学农业与生物学院，上海200240) 摘要：【目的】水稻条斑病菌 (XanthomonasoFyzaopv．oryzicola)中单链DNA结合蛋白 (single—Stranded DNA—bindingprotein，Ssbx)通过病原菌 III型分泌系统 (type-III$ecretionsystem，T3SS)分泌，在非寄 主植物烟草上产生过敏反应 (hypersensitireresponse，HR)，研究旨在明确Ssb激发烟草产生HR的机理。【方 法】将水稻条斑病菌RS105菌株注射水稻和烟草叶片，应用 CreatorSMARTeDNA文库构建试剂金构建水稻和烟 草eDNA文库，借助 pGADT—SfiAB载体上特殊酶切位点SfiI，酶切检测水稻和烟草cDNA文库质量；以Ssb为诱 饵，通过酵母双杂交技术 (Y2H)从水稻和烟草eDNA文库中筛选在sD／一Ade／一Leu／一Trp／一His培养基上能够生长 的阳性克隆；并利用 -gal试验验证阳性克隆；序列测定后，使用MEGA4序列分析软件，并利用邻位相连法 (neighbor—joining,NJ)对筛选获得的互作因子进行同源序列和系统进化树分析；利用荧光双分子互补试验 (BiFC)于488nm处黄色激发光和52O一550nm透射光、20×物镜下，在激光共聚焦显微镜 (LeicaTCSSP5-II) 观察 Ssbx与烟草和水稻中互作因子的互作位点。【结果】水稻和烟草 eDNA文库构建和质量检测结果显示，随机挑 选 2O个克隆中水稻来源的eDNA插入在pGADT-SflAB载体上，平均片段大小 1．0kb；随机挑选 20个克隆中烟草 来源的eDNA均插入在 pGADT—SflAB载体上，平均片段大小 1．2kb，说明水稻和烟草的eDNA文库构建质量较好； Y2H和 一gal试验结果显示，Ssbx可与烟草和水稻的ADF2(aetin-depolymerizationfactor2)蛋白互作，使 酵母AH109能够在 sD／一Ade／一Leu／一Trp／一叭s平板上生长，并且 -gal染色显示为蓝色。水稻 OsADF2编码139 氨基酸，蛋白质分子量为 15．9kD，而烟草NbADF2编码 137氨基酸，蛋白质分子量为15．8kD，两者同源性达69．02％。 同源性以及系统进化树分析显示，植物中ADF2广泛存在，同源性高达 60％以上。双子叶植物烟草和拟南芥的ADF2 同源性最高，相似性达 69．05％；单子叶禾本科植物水稻和狗尾草的ADF2同源性最高，相似性为88．81％。BiFC试 验结果显示，在 488nm波长的激光共聚焦显微镜下，仅 Ssbx和 OsADF2以及 Ssb和NbADF2共同存在时，可在烟 草细胞膜上显示黄色荧光，与阳性对照显示黄色荧光一致，说明Ssb可与OsADF2或NbADF2互作，互作位点发生 在植物细胞膜上。【结论】通过T3SS分泌的水稻条斑病菌中的Ssb，在植物细胞膜上与ADF2互作，从而激发植物 的免疫性。这为进一步揭示Ssb如何激发植物产生HR的机制提供了依据。 关键词：水稻条斑病菌；单链DNA结合蛋 白；肌动蛋白解聚因子；酵母双杂交；荧光双分子互补；过敏反应 IdentmCatiOnofaProteinbothinTobaccoandRicethatInteracts withanHR—elicitorSsbxofXanthomonasoryzaepv．oryzicola SUNYu-jing，MAWen-xiu，CAILu-lu，LIULiang，ZOULi—f