青花菜纤维素合成酶基因(BoiCesA)的克隆和功能验证.pdfVIP

园 艺 学报 2011，38(增刊)：2550 http：／／帆ahs．∽．ca HorticulturaeSinica 26．corn Acta E—mail：yuanyixuebao@1 青花菜纤维素合成 功能验证 王颖，赵冰，郭仰东· (中国农业大学蔬菜学系，北京100193) 蔬菜中含有丰富的纤维素，是人们日常饮食中膳食纤维的主要来源。调控蔬菜作物中纤维素含 量是兼顾营养与口感品质的关键。本研究旨在克隆青花菜中纤维素合成酶基因并进行基因功能验证， 为深入研究青花菜中纤维素的生物合成，及纤维素缺失一多糖代谢等反馈与补偿的生理适应机制的 研究提供理论基础。 借鉴亲缘关系相近的模式植物拟南芥作为契机设计引物通过RT-PCR方法克隆青花菜纤维素合 成酶基因的大部分编码序列，同时分析基因及推测蛋白的结构，并且在该序列上选择特异性较高的 区域构建RNAi载体，以期验证该片段所在基因的功能。 利用分离的植物纤维素合成酶基因的Cellulose synt结构域为检索序列，从NCBI和其它数据库 中调取已完成测序的物种的纤维素合成酶的氨基酸序列，共涉及10个物种的171个基因，基于以上 氨基酸序列，应用MEGA4．0生成系统进化树。结果表明CesA基冈和Csl基因的分化可能在单子叶 和真双子叶植物分化之前，单子叶和真双子叶植物的最近共同祖先中至少存在7个CesA基因，综 合已知的模式植物CesA基因的功能(初生壁或次生壁形成特异性)，可为推测其它物种该基因的功 能提供帮助。 根据己知的拟南芥纤维素合成酶基因保守序列设计特异引物，通过RT-PCR从青花菜叶片中克 575 隆出纤维素合成酶CesA基因片段。该cDNA片段长度为2 bp，推断的氨基酸序列编码产物为 858个氨基酸残基，其中包含高度保守的纤维素合成酶催化活性结构域的3个天冬氨酸残基和 QxxRW区。 选择该序列中268 I，AscI／Swa I／@e I酶切连接至载体pFGCl008， bp的特异片段经BamH 构建重组的RNAi载体pFGCCesA，并经农杆菌介导法转化青花菜。获得的转化株的形态表征为植 株明显变矮，叶片远轴面紧邻维管组织出现肿胀，表皮细胞变形气孔开度异常，透射电镜观察到叶 绿体结构变化为梭形且淀粉粒降解，出现较多的嗜锇体。测定了10个转基因植株及非转化对照叶片 的纤维素和果胶含量，转化株的纤维素合成下调了40．4％，果胶含量也减少了19．6％。半定量RT-PCR 分析证实了RNAi诱导元件的表达抑制了内源CesA基因的表达。说明了导入CesA基因的特异片段 形成的发卡结构影响了内源靶基因的表达，证实了该基因片段与纤维素合成相关。 关键词：青花菜：纤维素合成酶；RNAi：转化 中图分类号：S635 文献标识码：A 文章编号：0513．353X(2011)S．2550-01 收稿日期；201l—08一18 基金项目：国家重点基础研究发展计划项目(2009CBll9000) 。通信作者(E-mail：腆edu．cn-1H：010