家族性高胆固醇血症患者LDL受体基因新突变体功能的研究.pdfVIP

家族性高胆固醇血症患者LDL受体基因新突变体功能研究 硕士研究生：王海红导师：王绿娅首都医科大学附属北京安贞医院 【摘要】 背景家族性高胆固醇血症(FH)是一种常染色体显性遗传疾病，主要表现 为血浆低密度脂蛋白胆固醇水平大幅升高，肌腱黄色瘤，以及早发冠心病。该病可分为纯合 子和杂合子两种类型，在世界范围内杂合子发病率为l／500，约50％男性患者及15％女性患 者到50岁时会死于心肌梗死；纯合子发病率仅为l／1000，000，但是症状严重，在青少年时 期即发生动脉硬化甚至心肌梗死而死亡，给家庭及社会带来了沉重的负担。目前公认的FH 酶9(PCSK9)等3种基因突变。其中，LDLR为最主要的致病基因。以功能为基础，突变可 划分为5型。迄今为止，世界范围内已报道了LDLR基因1200多种突变。我们前期在我国 FH患者中发现了一些新的突变，但突变是否具有致病性以及属于几型突变尚需要通过细胞 学功能验证。分析基因突变对低密度脂蛋白(LDL)受体功能的影响并初步阐明其致病机制， 可为患者的合理治疗提供科学依据。 耳的 为研究LDL受体基因新突变体的功能及其致病机制，本研究收集4例FH先证者 及其核心家系，通过DNA测序检测其突变基因，并在核心家系中验证。构建LDLR突变体， 并进行细胞转染，利用激光共聚焦显微镜观察突变体亚细胞定位及内吞能力，利用流式细胞 术检测细胞表面突变体表达量及内吞功能，最终确定其致病性，并初步阐明其致病机制。 方法1．根据FH的诊断标准，对4例FH先证者进行病史询问及体格检查； 2．对4例FH先证者进行生化检测及心脏／大血管超声检查； 3．抽取患者其及家系成员空腹外周静脉血，提取基因组DNA(gDNA)； 4．通过PCR对LDLR、apoB及PCSK9的编码区域进行扩增，扩增产物经纯化后进行测序； 5．测得的突变位点对应片段在其双亲中进行测序验证； 6．以野生型LDLR质粒为模板，用QuickchangeXL定点诱变试剂盒对突变基因进行诱 变，构建LDLR基因突变体： 7．纯化LDLR基因突变体，并测序验证； 8．将野生型及突变质粒转染HE卜293细胞，并培养； 9．用激光共聚焦显微镜(CLSM)鉴定转染细胞中的LDLR蛋白的亚细胞定位及其内化 LDL的能力； 10．用流式细胞术检测细胞表面LDLR表达量及其内吞LDL活性。 结果1．收入的4例FH先证者均符合临床FH诊断标准，皮肤及肌腱多发黄色瘤； 2．先证者血浆胆固醇水平大幅增高(11．98”16．87岫01／L)，颈动脉内膜中层不同程度 增厚并伴发斑块； 3．成功提取先证者gDNA，纯度及浓度均符合要求； 4．先证者均无apoB及PCsK9基因突变，而存在LDLR杂合错义突变，分别为C201F、 oneafdlova亭cular FiveCont；nentIntefna№傀}CO耐erence 0ise矗se and30-Year of Annivers舂叫Meet；ng8电霹嘲An2h电nH嚣p鹣{蒯l{a健Id把C盎p瞧l蛔edicalun肆辩晦 一593— G615V、Y398X及G186C； 5．先证者家系中检测出相同基因突变，先证者的基因突变来自于其父母； 6．成功诱变LDLR基因突变体； 7．所构建的LDLR基因突变体为目的质粒； 8．成功将质粒转染入HEK一293细胞，转染效率为55％’60％； 9．突变体LDLR蛋白均部分潴留于内质网，且仍保留一定内化LDL能力，属于2B型突 变； 10．突变体细胞表面LDLR表达量及其内吞LDL活性均明显下降，LDL受体功能受损。 结论1．收集的4例先证者均符合FH临床诊断标准，其中2号先证者为纯合子，其余 3例先证者均为杂合子； 2．先证者存在LDLR基因4种突变，且均为新突变，并分别来自于父母； 3．成功构建4种LDLR突变体； 4．突变体均部分潴留于内质网，不能有效转运至细胞表面发挥作用，属于2B型突变； 5．突变体细胞表面受体表达量及内吞LDL活性均明显降低，为致病性突变。 综上所述，本文通过收集4例临床确诊的FH患者及其核心家系，筛选其突变基因，确 定其遗传