姜黄素抑制大肠癌细胞增殖和其机制研究.pdfVIP

姜黄素抑制大肠癌细胞增殖及其机制研究 张振书陈宏 第一军医大学南方医院全军消化内科研究所(广州510515) 大肠癌是一种全世界范围内的常见恶性肿瘤，其预防和治疗仍任重道远。非甾体类 抗炎药(NsAⅡ)s)如阿斯匹林、炎痛喜康、吲哚美辛及舒林酸等已被认为是有效的化学预 防药物”o，j-。流行病学和动物模型实验研究已提示NLIDs可降低大肠癌发生的危险 性及抑制大肠肿瘤形成，并认为是通过抑制花生四烯酸(AA)代谢途径中的环加氧酶 (o。X)的活性而实现的”o。既往研究显示N掣山)s通过阻断肿瘤细胞周期的G1期而发 挥其防癌作用的”o’。然而，NsAIⅨ类化学合成药物对人体都有较大剐作用”1，寻找和 筛选高效低毒的天然抗癌物质已成为国内外研究者们关注的热点。 姜黄紊(curcurllin)是一种中药姜黄根茎中提取出来的天然化合物，已广泛用作食品 色素和香料。早期研究证明姜黄素具有抗炎、抗氧化、清除自由基及抗癌等药理作 用”40。毒理实验研究认为姜黄素无毒副作用”1。既往研究表明姜黄紊可抑制体外淋巴 瘤细胞的生长，增加淋巴瘤动物的存活时间及诱癌荆n)A、PMA、AOM诱导的肿瘤促 发“…。其机制体可能是姜黄索可抑制花生四烯酸(AA)代谢途径的环加氧酶(COx)和脂 酪氨酸蛋白激酶(TPK)等活性。然而，姜黄索的抗癌机制并不完垒清楚。近来的资料认 为，姜黄素抑制结肠癌}rr～29和HCT一15细胞增殖主要是通过阻滞细胞周期的G2州 期，而不是诱导细胞凋亡的作用…’。然而，最近文献报道长期姜黄素饮食与对照餐比较， 可明显增加AOM诱导的雄性F344大鼠的结肠肿瘤细胞(如白血病细胞HL一60、结肠 本研究旨在探讨姜黄素对结肠癌细胞的抗癌作用及明确其作用机制是否涉及葵黄紊对 细胞周期的阻滞和诱导细胞凋亡的作用。 材料与方法 1．姜黄素溶液的配制 以少量二甲基亚碾(D搬的)溶解姜黄素糟荆(SgIlla．O。， 释萤黄索到所需浓度，使古D1“S00．1％。 2．细胞株和细胞培养 人结肠腺癌细胞株LovD细胞引自美国A矾Z(R(斌viUe， 牛血清、胰岛紊10ng／“、青霉素100u／砒、链霉素100u／“、二性霉索0．珥喀／甜、2㈣l／ ·236· L谷氨酰胺，置于37℃、5％(D2培养箱中单层贴壁培养。 3细胞生长抑制曲线 将对数生长期细胞用O．25％胰蛋白酶一O．02％El兀～消化 液消化成单个分散细胞，计数后按每孔5000个细胞种人24孔培养板中，置37℃孵箱培 复孔，取其平均值作为处理后不同时间段的细胞数。结果以时问为横坐标，细胞数为纵 坐标计算机绘图，得出细胞生长抑制曲线。 4．集落形成实验 将对数生长期培养L0v0细胞消化成单个细胞，计数后按每孔1 ×104细胞接种于8孔培养板中，37℃孵育过夜，使细胞完全贴壁。更换培养液，使姜黄 素终浓度分别为O脚ol／L、5衄∞l／L、10扯mol／L、15f衄01几、20f皿01／Land25脚I／L，各浓 度组设4各复孔，置37℃孵箱继续培养12天后，用2．5％戊二醛固定10分钟，HE染色， 计算每皿细胞集落数(每个集落须包含50个以上细胞)。实验重复3次。若浓度为 0脚I／L姜黄素的集落形成率为100％，按以下公式计算细胞相对增殖存活率(％) 100 细胞相对增殖存活率=(处理组集落形成率／对照组集落形成率)x 5．MrT 取对数生长期细胞制成单细胞悬液后计数，接种子96孔培养板中，每孔4 DI订S0 仪上测定各孔O．D．值。每组设8个复孔，取平均值按以下公式计算抑制率(瓜) IR(％)=100一(处理组O．D，值／对照组O．D．值)×loo 6．细胞周期分析 取对数和生长期的细胞以5，O×105细胞／瓶的密度接种于50rnj 培养瓶中，适应性培养24小时后，更换培养液使姜黄素终浓度分别为20f』rnoI／L和 40皿d几，对照组细胞更换不含姜黄素的培养液，分别在加药后的24小时、48小时中止 培养，以O．25％胰蛋白酶一O02％E翻认消化细胞，连同悬浮纽胞制成单细胞悬液。收 定，结果采用MuticleAv软件分析。 7．细胞凋亡的分析 采用吖啶橙荧光染色和透射电镜观察凋亡细胞的形态学改变 按文献““报道进行。DNA琼脂糖凝胶电泳分析方法：按姜泊