一株纤维素酶产生菌SWU6菌株的筛选鉴定.pdfVIP

第 34卷 第 4期 2014年 l2月 7 一 株纤维素酶产生菌 SWU6菌株 的筛选鉴定 吴晶晶 王爱印 周敏 陈林 谢洁 (西南大学生物技术学院，重庆 400715) 摘 要 为寻找高效纤维素降解菌，用于蚕沙及桑树废弃枝条等的加工处理，本研 究以羧 甲基 纤维素钠 (cMC—Na)为唯一碳源 ，从西南大学校 园土壤 中分 离纤维素降解菌 。结合测定菌株在羧 甲基 纤维素钠平板上 形成 水解 圈直径与其 菌落直径的 比值 ，及胞外酶活测定法 (DNS法)筛选 获得 一 株纤维素酶高产菌株 SWU6。该 菌株 24h发酵液上清液经 DNS法检测 纤维素酶活力达到 136．24U／mL。菌种鉴定结果表 明 SwU6菌株为革兰氏阳性芽孢杆菌 ；过氧化氢酶 、硝酸盐还原 呈 阳性 ；能水解淀粉 、液化 明胶 。基于 16SrDNA 的系统发育分析结果表 明 SWU6菌株与登录号 为NR116240的甲基营养型芽孢杆 菌(BacillusmP施 z0ro c“s)处于进化树的同一最小分支。 综合茵体及茵落形态特征 、生理生化实验结果 以及基于 16SrDNA 的系统发育分析 ，将 SwU6菌 株鉴定为甲基营养型芽孢杆菌(BacillusmP z0r0 c“s)。 关键词 纤维素酶产生菌 筛选 鉴定 蚕桑产业副产物蚕沙及桑枝富含纤维素 ，但均未被有效利用 。]。我 国仅 五大蚕区的蚕 沙年产量已超过 100万 tr4；2013年我国桑 园面积超过 84．7万 hm ]，桑树用 叶后产生大量 废弃桑枝。目前 ，大部分蚕沙被直接废弃或不经处理作为农 田肥料[1]，而桑枝常被废弃 田间或 焚烧 ]。蚕沙及桑枝现有处理方式 ，不仅带来极大的环境污染 ，也使蕴藏在其 中以纤维素为 主的生物质能源未被有效利用 。多种真菌 、细菌能通过产生纤维素酶而在 自然界纤维素的降 解过程发挥作用 ]。富含纤维素生物质原料 的酶解条件温和，且不带来次生环境污染，筛选 获得纤维素酶高产菌株对蚕桑产业副产物的有效利用具有重要作用 。 校园富含枯枝落叶的土壤有利于纤维素酶产生菌的富集 。在长期适应环境的过程 中，土 壤中存在的微生物可以通过分泌包括纤维素酶在内的多种酶类参与环境物质循环。本研究选 择从校园绿化林地土壤 中分离纤维素酶产生菌 ，通过刚果红培养基水解 圈法及胞外纤维素酶 测定方法筛选纤维素酶高产菌株 ，并对产酶菌株进行 了菌种鉴定 。以期为包括蚕沙、桑枝在 内 的富含纤维素生物质原料的降解及洁净能源的开发提供潜在生产菌 。 1 材料和方法 1．1 材料 1．1．1 土壤样品 采 自西南大学校园绿化地。 1．1．2 培养基配方 初筛培养基 (羧 甲基纤维素钠培养基)：CMC—Na15g，NH NO。lg，蛋 白胨 lg，MgSO · * 资助项 目：西南大学本科生科技创新基金项 目(No．1331002)。 通信作者 ：谢洁，博士，副教授 ，硕士生导师 。E—mail：healthjie@163．corn 8 蚕 学 通 讯 7H2O0．5g，KH2PO4lg，琼脂 20g，H2O1000mL，pH7．0，12l℃灭菌 20min后备用 ]。鉴别 培养基 (刚果红培养基)：KH2PO 0．5g，MgSO 0．25g，琼脂 18．0g，明胶 2．0g，CMC—Na2．0g， 刚果红 0．20g，蒸馏水 1000mL，pH7．0l9。液体发酵培养基 ：蛋 白胨 10g，酵母粉 10g，CMC-Na 10g，NaC11．5g，KH2PO4lg，MgSO ·7H2O0．3g，pH7．0 ，蒸馏水 1000mI。 1．2 方法 1．2．1 纤维素酶产生菌的分 离 称取 1g土壤样品加入到 99mL含有玻璃珠的生理盐水中，作为 10 稀释度 ，振荡 30min 混匀后做一系列 10倍稀释，将 1O 、101。、1O 稀释液各取 100x／L涂布于初筛羧 甲基纤维素 钠培养基 ，每个稀释度 2次重复。28~C培养 48h挑取生长较快 的单菌落在羧 甲基纤维素钠培 养基上纯化获得纯培养ll。 1．2．2 纤维素酶产生茵的筛选