GFP-PTS1与GFP-PTS2融合蛋白表达载体的构建与稻瘟病菌转化子的共聚焦分析.pdfVIP

GFP—PTS 1与GFP—PTS2融合蛋白表达载体的构建与稻瘟病 菌转化子的共聚焦分析 of 1 GFP．PTS2in ConstructionandFluorescenceLocalizationGFP—PTS oryzae Magnaporthe 王教瑜1吴小燕1，2杜新法1柴荣耀1张震1毛雪琴1邱海萍1王艳丽1孙国昌1’ (1．浙江省农业科学院植物保护与微生物所，杭州31002l；2．西北农林科技大学植物保护学院，杨 凌712100) GFP—PTS2的双元表达载体，转化稻瘟病菌，筛选单拷贝插入转化于，在共聚焦显微镜下观测。结果显示，GFP—PTSl 与GFP．PTS2转化了细胞中荧光呈点状，多位于细胞周围，而不含PTS的GFP转化子中荧光均匀分散于细胞质．表明 子中荧光点的密度高于菌丝中。本研究为稻瘟病菌过氧化物酶体动态变化与相关基因研究以及特异性药物筛选提供了 基础和于段。 关键词：绿色荧光蛋白：PTSl；盯S2；稻瘟病菌；共聚焦分析 过氧化物酶体(peroxisome，P)是一类单层膜包被的细胞器。广泛存在于真核细胞中。P基质中 包含50多种酶，参与脂肪酸B一氧化、乙醛酸循环、胆同醇合成、活性氧产生与消除等多种生理生化 过程。P发生机制在酵母与哺乳动物相对深入…，P基质蛋白在细胞质中合成，靠自身序列所具有的 定位信号(Peroxisome targetingsignal，盯S)而被识别和转运进入基质内。根据序列和位置的不同， 互作与分工情况各不相同¨J。 植物病原真菌中P发生机制的研究起步较晚。豆类炭疽菌(Colletotrichum 是植物病原真菌克隆的首个PEX基刚3l，而后稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)的PEX6基因也得到 了分析i41。PEX6基鲥的研究初步表明了P在植物病原真菌致病过程中的作用，但到目前，植物病原 为了进一步研究植物病原真菌P的发生机制，我们构建了GFP．盯s1与GFP．PTS2的融合蛋白表达载 体并转化稻瘟病菌，通过激光共聚焦对转化子的荧光表达与分布进行了分析。 l材料与方法 1．1菌株 coli菌株为DH5a：农杆菌菌株为AGLl。 稻瘟病菌菌株为Guyll；大肠杆菌Escherichia 1．2载体构建 摹金项目：浙江省自然科学基金(No．Y306638)。 作者简分：王教瑜，搏士，从事真菌分了生物学研究：E-mail：jiaoyuwangI@gmail．COITI。 通讯作者：孙国昌，博士，研究员，从事植物病理学研究：E-mail：sungc01@sina．tom。 119 pCAMBIAI PI300BMGFPA与P1300BMGFPB。 1 3真茴转化与转化子筛选殛杂交验证 利刖农杆菌介导法进行真菌转化，枉单胺麟培养基平板上筛选转化子。提取转化子DNA，利用 PCR检测GFP序列；DNA经EcoRl消化，阻GFP为探针进行Sout}lem杂交。 1 4转化子的荧光观察 在CM甲板J挑敬苗丝与孢f．利用荧光显微镜与北聚焦显微镜对观察荧光表达与定位情况。 2结果 2 l双元载体的掏建与转化于获得 双元表选戟体p13t30BMGFP、pl 各不相同：pl 达。 H 『IⅢ 卜乜 ——■口■KJ二二亟蔓] 2．2真菌转化与转化子验证 表叫：在挑舣的∞个转化子中．除4个苗株外都能检测到GFP片段的存在：并日大部分转化于为单 拷贝插入．荤拷贝率为83％。 23转化子的荧光观察 d荧光显微镜F及共聚传显微镜F现察菌丝与孢子的荧光表达及定位情况．结果如嘲3。在MPGI 基吲启动千的作用F．GFP布稻瘟病苗的饱子、苗丝中部有较高丰度的表达，以抱子中的荧光为塌亮。 种转化子中，荧光呈点状分布：啊作为对照，在无PTS的GFP转化子中，