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改良植块法培养成年雪旺细胞 蒋良福 高伟阳 陈星隆 李志杰 洪建军 温州医学院附属第二医院手外科（325027 ） 雪旺细胞（SC ）在周围神经再生中的作用已被广泛证实。SC培养是对SC进行生物学研究的基 础。新生大鼠神经组织虽取材量有限，但含结缔组织量较成年动物少得多，易于分离，便于培养， 因此对SC进行生物学研究多取材于新生大鼠。但为避免免疫排斥而在动物或人进行同体SC移植时， 则涉及到成年动物或人的SC培养问题，因此探索成年动物SC在体外增殖纯化的方法具有一定实际意 义。SC培养目前主要采用酶消化法和植块法，由于成年动物神经组织含结缔组织多，细胞相对量少， 酶消化法虽然获得SC速度快，但混入成纤维细胞而纯度不高，而且消化时间不容易掌握，过长则容 易损伤细胞。植块法虽然获得SC纯度高但由于细胞迁移速度慢，培养所需时间长。我们探索将两种 方法优点结合，通过短时间酶消化松散植块后再进行植块培养，以期能够快速获得高纯度的雪旺细 胞。 1．动物与分组 1.1 实验动物：SPF级Sprague-Dawley雄性大鼠20只，体重200g～250g 。 1.2 实验分组：分A 、B二组，每组10只大鼠。A组采用改良植块法；B组采传统植块法。 2 ．实验方法 2.1 取材 每只大鼠以1%戊巴比妥钠（40mg/kg ）麻醉，双侧坐骨神经于梨状肌下缘切断预变性。一周后 过量麻醉处死，75%酒精浸泡3分钟，迅速取双侧坐骨神经2.0cm长。将神经置D-Hanks液冲洗两遍， 3 显微镜下剥除神经外膜，称重20～30mg 。在D-Hanks液中将神经分成细束，用显微剪刀剪成约1mm 大小。 2.2 传统植块法 每只大鼠坐骨神经植块种植于一个预先涂有多聚赖氨酸（sigma公司）的培养皿，共10皿。以少 量培养液润湿后静置37℃的5%CO2培养箱中，一小时后加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，隔日 换液，每5天将植块移入另外一个培养皿继续培养，共培养3次。 2.3 改良植块法培养 每只大鼠坐骨神经植块加入0.03%胶原酶（XI型，sigma公司）3ml吹打后，37℃水浴振荡消化20 分钟。用D-Hanks液洗涤、离心2次。加入含10%胎牛血清DMEM2ml吹打，移入一个培养皿（预涂多 聚赖氨酸，使培养基刚好漫过植块，共10皿。培养一小时后追加培养基。置含5%CO2 的37℃培养箱 培养，隔日换液，每5天将植块移入另外一培养皿继续培养，共培养3次。 2.4 细胞计数 第 5、10、15 天植块移走后，各取 5 个培养皿，0.125%胰蛋白酶（sigma 公司）消化后，洗涤 56 离心后稀释到 1ml。每皿白细胞计数器细胞计数3 次取均值。 2.5 细胞传代纯化 第 5、10、15 天植块移走后，各取 5 个培养皿的细胞传代纯化，吸出培养基，D-Hanks 液冲洗 两遍，加入 0.125%胰蛋白酶 2ml 消化 3 分钟，相差显微镜下观测见 SC 变圆，轻轻振荡后，成片浮 起，而成纤维细胞仍然大部分贴壁。吸出消化液，加入 4ml 含 10%血清 DMEM 终止消化，离心 1500rpm10 分钟，去上清。加入 5ml10%血清 DMEM ，吹打后，置培养皿，10 分钟后轻轻振荡移入 另一培养皿，利用成纤维细胞体积大贴壁快的特点，差速贴壁除去。重复差速贴壁一次，用 10%胎 牛血清 DMEM 培养。 2.6 S-100细胞免疫化学染色 植块培养第5、10、15天细胞计数后的细胞，及传代纯化后培养3天的细胞滴于玻片培养24小时 后分别做S-100染色。PAP法作S-100蛋白免疫细胞化学染色，程序如下：（1）标本用0.01mol/L磷酸 缓冲液（PBS ）洗涤2次，每次5min 。2%～4% 、pH7.2 的多聚甲醛（PFA ）4 ℃固定1～2h 。（2 ）0% 甲 醇加3%双氧水封闭内源性过氧化物酶10min。（3 ）正常兔血清37℃孵育30 min后吸干净。用抗S-100 多克隆抗体（CHEMICON ）4 ℃孵育24～48h 。（4 ）HRP标记的羊抗鼠抗体（CHEMICON ）。（5 ）加 PAP复合物（1 ∶200 ）37℃孵育1h。以上各步骤之后均以0.01mol/