中国特有小型猪中内源性反转录病毒的大规模筛查.pdfVIP

中国特有小型猪中内源性反转录病毒的大规模筛查 马玉媛吕茂民章金刚’ 【摘要】本研究对中国特有小型猪七个猪种中猪内源性反转录病毒(PERV)的存在与表达状况 进行了大规模筛查。根据目前通用的囊膜基因分型方法设计．了型特异性引物，利用PCR方法进行分型检 测。此外，对五指山猪、巴马小型猪中该病毒的核心蛋白基因(gag)、多聚酶基因(p01)及囊膜基因 (el／V)的存在与表达状况也进行了检测。结果表明，348份被检基因组DNA样品中均有PERV的存在， 表达。本研究获得了国内PERV的分子流行病学的详细资料。研究结果还表明可以通过选择育种来培育 c亚型存在的猪种。 PERv低负荷尤其是无PERV 【关键词】猪内源性反转录病毒；中国小型猪；异种移植 猪作为异种移植的最佳供体已经得到科学界的一致认可：然而人类却因此面临感染猪内源性反转录 endogenous 病毒(porcine 细胞系和其他一些物种，而PERv-C除能感染一种人源细胞系外其感染性主要局限于猪细胞系12’4】。 中国特有小型猪遗传背景清晰，个体间仅存在微小差异【5】，因此可望成为异种移植的良好供体。目 前，国内尚缺乏小型猪中PERV分子流行病学的充分资料，为此，我们开展了对小型猪中PERV存在与表 达状况的大规模筛查，这对进一步开发利用和保护这些良种资源具有重要意义，也为进一步研究PERV 与异种移植的安全性打下了基础。 1．材料与方法 1．1材料 1．1．1检测样品共采集五指山猪、巴马小型猪、中国实验小型猪、贵州小型猪、剑河香猪、巴马 香猪及版纳小型猪7个猪种共348份外周血样品。 Marker DNA聚合酶、DNADL2000等购自TaI出a生物工 公司；TRIzol试剂为Invitrogen公司产品；rTaq 程公司。 1．2外周血淋巴细胞的分离 自小型猪前腔静脉采集EDTA抗凝血，采用淋巴细胞分离液分离得到 外周血淋巴细胞(PBLo利用Trizol试剂制备PBL总RNA。 1．3PBL 【基金项目】十五国家科技攻关重点项目(2004BA717B·02-04)：国家自然科学基金； 北京市自然科学基金(5032015)资助项目 +【通讯作者】章金刚，Tel／Fax：010E·maii：zhangig@nic．bmi．ac．ca r 70。C备用。 1．4引物的设计与合成 根据已发表的PERV核苷酸序列，设计并合成了三对引物分别用于检NPZRV gag、pol、已n1，基因， 体序列见表1： 表1PERV存在检测引物与分型引物 引物名称 核苷酸序列(5’-3’) ，PCR产物长度 1．5PCR扩增与分析 buffer ．PCR反应在209L体系中进行，取100ngPBL的基因组DNA作模板，依次加人10×PCR 2／．tL， 1 0mmol／L dNTP混合物2儿，上、下游引物各20pmol，rTaq DNA聚合酶1．2U，加无菌去离子水!i5209L。 检测PERV oC45s．72。C 序为：92C变性4min；94。C30s一53 MarkerDL 退火温度由53℃改为58。C，其余皆和A、B型相同【41。在扩增结束后取PCR产物109L与DNA 和281bp。取PKl5细胞的