长链非编码RNA NEAT1对小鼠精子发生的影响.pdfVIP

第 35卷 第 12期 家畜生态学报 Vo1．35NO．12 2014年 12月 ActaEcologiaeAnimalisDomastiei Dec．2O14 。 ‘。 。 。 6科学研究 9 ．o ．o ．。 ．。 ． 长链非编码 RNANEAT1对小鼠精子发生的影响 胡 源 ，曾文先 (西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100) [摘 要] 为研究长链非编码 RNANEAT1对小鼠精子发生的影响，构建针对NEAT1的干 扰载体并包装慢病毒 ，通过将干扰慢病毒注射到成年小鼠睾丸曲细精管和定量 PCR，H．E． 染色等方法观测 NEAT1对 小鼠精子发生的影响。研 究结果表 明，NEAT1在睾丸组织和 GC一1生殖细胞系中表达；成功构建 CD513B—U6一NEATl干扰载体，利用第三代慢病毒包装系 统包装获得干扰慢病毒且干扰效果明显 (NEAT1转录本水平下调 69 )；慢病毒注射试验结 果显示干扰病毒注射组睾丸指数轻微增加 ，有精子发生的曲细精管比例 由9796／减少为 86 (P0．05)，表 明小鼠精子发生受到影响 ，NEAT1具有维持雄性小鼠精子发生的作用。 [关键词] 精子发生；NEAT1；长链非编码 RNA；RNA干扰 [中图分类号] $811．6 [文献标识码] A [文章编号] 1005—5228(2014)12—0011—05 长链非编码 RNA(1ncRNA)具有在细胞特异性 系统 ：CD513B-U6表达质粒及包装质粒 (pVSV—G 、 表达的特性 口]，参 与形成细胞核中的亚结构并调节 pGag—Pol、pRsv—rev)。 多种细胞活动和生物学过程 ，包括调控基因表达和 1．2 主要试剂与仪器 蛋 白质的活性 、干细胞 自我更新与分化等 ]。但关 PCR扩增仪 ；凝胶 电泳成像分析系统 (Bio— 于 lncRNA在小鼠精子发生过程 中的作用及其调节 rad)；二氧化碳培养箱 (Thermo)；超净工作 台(苏 机理 目前尚未见报道 。lncRNANEAT1作为核心 州)；台式低温离 心机 (Sigma)；超纯水制备系统 组分参与形 成旁斑 (paraspeckle)结 构I3]。敲 除 (Mill—Q)；立式压力蒸汽灭菌锅 ；荧光倒置显微镜 NEAT1影响 DBHS (Drosophilamelanogasterbe— (Olympus)，二氧化碳培养箱 (Thermo)。 havior，humansplicing)蛋白在细胞中的定位 ，从而 1．3 NEAT1表达检测 影响旁斑结构 的形成 [4-5]。而旁斑可以阻滞成熟 RNA提取 ：使用 Trizol法提取细胞总 RNA；反 mRNA的出核与后续翻译 ]，参与调控细胞的分化 转录 PCR：使用 TaKaRa公司 PrimeScript州 RT 和生长[78]。在细胞分化的过程中NEAT1的表达 reagentKitwithgDNA Eraser试剂盒 ；PCR：使用 升高 。本研究 旨在探索 NEAT1对维持小 鼠精 TaKaRa公司 ExTaq@试剂盒，引物信息如下 ： 子发生所起的作用 ，为雄性动物 的精子发生过程和 上游引物 ：TACATGGGGGCAGTGTCCT