成纤维细胞Ⅰ型胶原基因shRNA载体的构建及干扰效果.pdfVIP

· 3792- 广东医学 2014年 12月 第35卷第24期 GuangdongMedicalJournalDec．2014，Vo1．35，No．24 成纤维细胞 I型胶原基因shRNA载体的构建及 干扰效果 张培华 ，刘茂胜 ，曾国芳。，李瑾 ，段剑峰 ，刘宏伟 。暨南大学第一临床医学院(广州510632)；广东医学院附属医院整形外科研究所 (广东湛江524001) 摘【要】 目的 构建有效针对人成纤维细胞 I型胶原基因的shRNA干扰载体，检测RNA干扰后对病理性瘢 痕成纤维细胞胶原合成的影响。方法 设计合成 4对针对人 I型胶原基因的shRNA靶序列 (shRNA1、shRNA2、 shRNA3、shRNA4)，将合成的shRNA片段通过重组技术克隆到真核表达载体pmU6，经酶切与测序验证表明成功 构建针对人 I型胶原基因的shRNA干扰载体 (Col—shRNA1、Col—shRNA2、Col—shRNA3、Col—shRNA4)，并将该 干扰栽体与空载体分别通过脂质体转染人的病理性瘢痕成纤维细胞 (依次为Col—shRNA1组、Col—shRNA2组、 Col—shRNA3组、Col—shRNA4组、空载体转染组)，另选未处理的成纤维细胞作为空 白对照组，采用RT—PCR与 羟脯氨酸含量测定试剂盒检测该干扰载体的干扰效应。结果 酶切与测序结果表明成功构建 了针对人 I型胶原 基因的shRNA干扰载体。I型胶原基因mRNA的相对表达水平在空白对照组与空载体转染组之间差异无统计学 意义(P0．05)；而干扰组 Col—shRNA(1～4)与空载体转染组之间比较，差异有统计学意义(P0．05，P 0．o1)。空白对照组与空载体转染组的羟脯氨酸含量及胶原合成差异无统计学意义，干扰组(Col—shRNA1、Col— shRNA2、Col—shRNA3、Col—shRNA4)的羟脯氨酸含量和胶原合成与空载体转染组比较，差异有统计学意义(P 0．05，P0．()1)。结论 成功构建了4组有效针对人 I型胶原基 因的shRNA干扰载体，它们均能明显抑制病理性 瘢痕成纤维细胞 I型胶原基因的表达与减少细胞胶原的合成，其 中Col—shRNA1对成纤维细胞 I型胶原基 因表 达的干扰效果最强。 【关键词】 病理性瘢痕；成纤维细胞；I型胶原；短发夹RNA；基因沉默 Constructionoffibroblasthumantype IcollagengenetargetedshorthairpinRNA expressionvectoranditsin· terferenceefficacy． ZHANGPei—hua”，LIUMao—sheng，ZENGGuo一 ng，LIJin，DUANJian—feng，LIUl-long— wei． FimtClinicalCollegeofJinanUniversity，Guangzhou510632，China Correspondingauthor：LIUHong—wei．E—mial：liuhongwei0521@hotmail．con A【bstract】 Objective ToconstructexpressionvectorsofshorthairpinRNA(shRNA)effectivelytargetinghu— mantype Icollagengeneandtodetecttheirinterferenceeffectsoncollagensynthesisinthefibroblastsfrompathological cicatrix．Methods FourpairsofshRNAsequencestargetinghumantype I collagengeneweredesignedandsynthe— sized，andthenfollowedbyannealandrecombinationintoeukaryotieexpressionvectorpmU6，whichwasevaluatedand identifiedbyenzymedigestionandsequencing．TheshRNArecombinantvectorsandcontrolemptyvectorswererespective— lytransfeetedintofibroblastsfrom pathologicalcicatrixby liposome．Reversetranscription—polymerasechain reaction (R