淀粉酶发酵实验方案.docVIP

综合实验一 α-淀粉酶的摇瓶发酵 实验目的 掌握微生物发酵的基本流程； 通过淀粉的发酵制过程掌握菌种制备、发酵过程控制、中间参数测定等基本生物工程技术。 实验原理 枯草芽胞杆菌 DNS法测还原糖 α-淀粉酶活性测定 α-淀粉酶效价测定 仪器与材料 发酵培养基：葡萄糖（1.5%），玉米淀粉(0.2%)，酵母膏(0.02%)，蛋白胨(3%)，氯化铵(0.01%)，硫酸镁(0.05%)，磷酸二氢钠(0.15%)，磷酸氢二钠(0.3%)； 菌种：枯草芽胞杆菌； 试剂：1mol/L NaOH，1mol/LHCl、pH6.0的磷酸缓冲液、葡萄糖标准液（1mg/mL）、DNS溶液（棕色瓶储藏）、稀碘液、LB液体培养基（蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L，氯化钠10g/L）等； 其它：天平，药匙，广泛pH试纸，玻璃棒，不锈钢烧杯，250ml的三角瓶，纱布，报纸，棉线，电炉，电磁炉，带塞比色管，试管架，漏斗，1ml、5ml移液管，洗瓶，废液瓶，蒸馏水，滤纸，比色皿，取液器，枪盒，枪头，酒精灯，打火机，振荡培养箱，分光光度计，水浴锅等。 实验方法 菌种活化：将保藏的菌种转接到斜面培养基上，37℃培养24h； 种子液制备：取一环活化的菌种接入装量为50mL的种子培养基，37℃，180rpm培养18h； 接种培养：分别取2ml种子液，接入到发酵培养集中固定置恒温振荡培养箱中，32℃，160rpm培养48h. 葡萄糖标准曲线的绘制 分别取葡萄糖标准液（1mg/ml）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于25ml带塞比色管中，分别准确加入DNS试剂2ml，沸水浴加热2min，流水冷却，用水补足到15ml刻度。在540nm波长下测定吸光度。 发酵液：取发酵液5ml，过滤，备用； DNS测定：取发酵滤液适当稀释，使糖浓度为0.1-1.0mg/ml，取稀释后的糖液1.0ml于15ml刻度试管中，加DNS试剂2.0ml，沸水煮沸2min，冷却后用水补足到15ml刻度，在540nm波长下测定吸光度。从标准曲线查出葡萄糖mg/ml数。求出样品中糖含量； α-淀粉酶活性的测定：吸取20.0ml可溶性淀粉溶液于试管中，加入5.0ml缓冲液摇匀后，于60±0.2℃恒温水浴中预热5min。加入稀释好的待测酶液1.0ml，立刻计时，摇匀，准确反应5min。立即吸取1.0ml反应液，加到预先盛有0.5ml盐酸溶液（0.1mol/ml）））酒石酸钾钠18.2g，溶于50ml蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸0.03g，NaOH2.1g，苯酚0.5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至100ml，贮于棕色瓶中，室温保存 但是一定要注意，3，5-二硝基水杨酸和NaOH的加入时间一定要很近，或者是先加入NaOH。否则会产生难溶的沉淀，导致配制溶液失败。且配置过程中，溶液加热温度不宜超过50摄氏度。））））DNS即二硝基水杨酸法是利用碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量的。因其显色的深浅只与糖类游离出还原基团的数量有关，而对还原糖的种类没有选择性，故DNS方法适合用在多糖（如纤维素、半纤维素和淀粉等）水解产生的多种还原糖体系中。