酵母菌的制片与观察.docVIP

酵母菌的染色与观察 摘要：本实验通过用美蓝染色制成水浸片来观察酵母形态和出芽生殖方式。生长在培养基上的酿酒酵母为材料，进行子囊孢子的观察。 (McClary) 培养基 ( 葡萄糖－醋酸钠培养基 ) 有利于酿酒酵母子囊孢子的形成。 1材料 1.1菌种 酿酒酵母麦氏琼脂斜面培养物。 1.2溶液和试剂 葡萄糖，KCl，酵母浸膏，醋酸钠，琼脂，蒸馏水，5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液，95%乙醇，0.01%美兰水溶液。 1.3仪器和其他用品 酒精灯，载玻片，盖玻片，显微镜，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，烧杯，试管等。 2实验步骤 2.1培养基的制备 2.1.1麦氏琼脂培养基的制备 麦氏（Meclary）琼脂培养基的配方如下： 成分 葡萄糖 KCl 酵母浸膏 醋酸钠 琼脂 蒸馏水 含量 0.2g 0.36g 0.5g. 1.64g 4g 200mL 113℃灭菌30min。 2.1.2液体培养基的制备 取0.5g酵母膏、1g蛋白胨、2g葡萄糖加入100ml水配制成液体培养基。 2.2斜面接种 无菌操作由酿酒酵母麦氏琼脂斜面培养物挑取菌种，在已冷凝好的斜面培养基上划线接种。 2.3培养 在28℃条件下恒温培养7d。 2.42.4.1制片 在载玻片中央加一滴0.1％吕氏碱性美蓝染液，无菌操作法取培养基中培养的酵母菌少许，放在吕氏碱性美蓝染液中，使菌体与染液均匀混合。用镊子夹盖玻片一块，小心盖在液滴上。 2.4.2镜检 3min后镜检。先用低倍镜观察，然后换用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。30min后再次观察。 干燥固定 待涂片自然干燥后，让菌膜朝上，通过火焰2～3次进行固定（以不烫手为宜）。 2.5.3染色 加5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，染色1.5min。 2..4水洗 轻轻冲洗，直至流出的水无色为止。 2.5.5乙醇脱色 用95%的乙醇脱色30s 2.5.6复染 用0.5%番红液染色30s1min。 2..7水洗 用水轻轻地冲洗，直至流出的水无色为止。 2..8镜检 先低倍再高倍，最后在油镜观察酵母菌。 3结果与分析 3.1实验结果 3.1.1美蓝浸片观察实验结果（见图1、2） 在高倍显微镜下可以看到，酿酒酵母菌为单细胞，呈卵圆形或圆形，个体较大，细胞内有明显的液泡。酵母菌无性繁殖主要是出芽生殖，出芽时，由母细胞生出小突起，为芽体(芽孢子) 图1 酵母菌形态结构（10×40） 图2-1 美蓝水浸片3min（10×40） 图2-2美蓝水浸片30min（10×40） 3.1.2 子囊孢子观察实验结果（见图3及分析） 图3 酵母菌子囊孢子形态观察（10×40） 通过染色镜检，酵母菌的子囊为圆形大细胞，呈现红色；其附近有2~4个圆形小细胞为酵母菌的子囊孢子，呈现绿色。这是因为先用着色力强的染色剂孔雀绿染色，子囊中残留染料经酒精脱色，而孢子一经染色难以脱色，后用番红染液复染，子囊被染成红色。 3.3思考题 根据你的观察结果，吕氏碱性美蓝染液的作用时间与酿酒酵母的死活细胞比例变化是否有关系？ 答：有。随着作用时间的延长，死活细胞的比例增大。 酿酒酵母除了通过出芽方式进行无性繁殖外，还可以形成子囊孢子进行有性繁殖，你在实验中是否观察到酿酒酵母的子囊孢子？ 答：通过染色，可以观察到酿酒酵母的子囊孢子为圆形的小细胞，呈现绿色。 4小结 通过本实验，了解了酵母菌的形态及出芽方式，并用美蓝染液水浸片法区别酵母菌的死活细胞，掌握了子囊染色观察方法，并了解酵母菌通过形成子囊孢子进行有性生殖。 本实验中滴加染液要适中，否则用盖玻片覆盖时，染液过多会溢出，过少会产生大量气泡。盖玻片要缓慢倾斜覆盖，以免产生气泡。染色的时间需要严格注意，在子囊孢子染色观察实验中，各步骤的时间要严格控制，以免影响实验结果。 参考文献： 1.沈萍 陈向东.微生物实验[M].4版.高等教育出版社，2007.70-81页 出芽细胞 芽体 局部放大图 子囊孢子 子囊