利用同序异尾限制内切酶.docVIP

摘要 介绍一种可以快速进行多基因片段克隆的新方法—— —同序异尾限制性内切酶 (isoschizomer-heterotail restrictionendonuclease，IHRE) 一步克隆法，该方法可以一步完成达 6 个 DNA 片段的连接，具有简单快速、节省试剂、成功率高、不引入非目的基因序列等很多优点. 应用该方法已经成功完成对人肠激酶轻链多基因克隆、HSV多表位 DNA疫苗的构建等. 分子生物学实验中，经常会遇到需要把多个基因片段连在一起的情况，比如构建多效价复合疫苗、真核基因多个外显子的拼接等. 一种常规的方法是在各片段两端设计不同的限制性内切酶识别位点，PCR 扩增出片段，为了保证粘性末端的正确性，分别用不同的内切酶剪切，回收酶切的 DNA片段，两两连接后再次 PCR 扩增，再酶切再连接.这种常规方法有很多缺点：a. 操作繁琐，耗用很多时间和试剂；b. 其中任何一步出现问题都会使最终的实验失败，成功率较低，并且由于中间操作环节太多，查找失败原因的难度也很大；c. 这种方法经常会引入酶切识别序列或粘性接头等非目的基因序列，影响后续实验研究. 我们在实验过程中建立了一种可以快速进行多基因片段克隆的方法—— —同序异尾限制性内切酶(isoschizomer-heterotail restrictionndonuclease，IHRE)一步克隆法，只利用一个限制性内切酶即可对多个 DNA 片段实现一步连接，具有快速、省酶、成功率高、不引入非目的基因序列等很多优点. 此方法与 Gene SOEing 方法[1]作用相似，可对多个基因序列进行正确拼接和克隆. 本实验方法建立的基础是有些限制性内切酶的识别序列和剪切位点的不一致性. 这类酶属于Ⅱ型限制性内切酶，有时又被称为ⅡS型酶，它们的特点是在识别位点之外的固定位置切开 DNA. 这些酶大小约为 400～650 个氨基酸，它们识别连续的非对称序列，有一个结合识别位点的结构域和一个专门切割 DNA 的功能域. 一般认为，这些酶主要以单体形式结合到 DNA 上，但与邻近的酶结合成二聚体，协同切开 DNA 链. 为方便，我们暂时将这类限制性内切酶命名为同序异尾限制性内切酶(IHRE)，即识别序列相同、切出的粘性末端不同.以 BbsⅠ酶为例，其剪切位点在识别序列之外的下游 N2～N6 位 (图 1)，且对剪切位置的碱基无限制，故可根据所扩增基因特异性要求选择相应的序列合成引物，多个扩增片段所用的引物都加有同一种限制性内切酶 (如 BbsⅠ) 识别序列，经酶切后形成的粘性末端各不相同，每两个片段首尾相接处的粘性末端是互补的，而与其另一端或其他片段的粘性末端是非互补的，这样多个片段经酶切后可以首尾依次相连，不仅保持了酶切条件的同一性 (所有片段可在一个条件下同时酶切)，而且保证了连接的特异性. 更为有利的是经过拼接后的片段内不含有该酶识别序列或残留碱基，能保证目的基因序列的正确性. 本方法中用的限制性内切酶剪切出的粘性末端 有 4 个碱基，这 4 个碱基可以根据需要任意选择 (只要不会引入新的不想要的酶切识别序列即可). 这样待连接的两个片段的前一片段后4 个碱基和后 一个片段前 4个碱基，加起来有 8 个碱基可以用来 设计粘性末端. 所以一般情况下都可以设计出满足 要求的引物. 我们实验室已经成功地应用同序异尾限制性内 切酶一步克隆法构建了多个多片段克隆载体，下面 以人肠激酶轻链基因 EKL (EK light chain，EKL)克 隆为例介绍该方法. 肠激酶 (enterokinase，EK，EC3.4.21.9) 是哺乳动物消化系统中最基础的丝氨酸蛋白水解酶之一. 该酶能高度特异性识别序列 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DDDDK)，将Lys羧基参与的肽键酶解开，并且能够在广谱pH (4.5～9.5)和温度(4～45℃)范围内特异性地水解底物[2]，融合蛋白经 EK 酶解获得的目标蛋白或多肽具有和野生型完全一致的氨基酸序列，因此 EK 目前广泛应用于切割融合蛋白中载体蛋白 (或标签序列) 和目标蛋白之间的肽键. 但目前市售的 EK 价格极其昂贵，特别是从十二指肠组织中纯化的 EK，常含有其他蛋白水解酶的污染，从而限制了其广泛应用. 我们通过基因工程手段来生产具有催化活性的人肠激酶轻链，其基因由 5 个外显子组成. 1 材料和方法 1.1 菌种、质粒和主要试剂 大肠杆菌菌株 DH5α ，温度诱导型原核表达载体pBV220 均为本实验室保存；小量柱离心式质粒抽提纯化试剂盒、胶回收试剂盒和 Taq plus 聚合酶购自上海申能博彩生物公司；T4 连接酶购自 NewEngland BioLabs；BamHⅠ、EcoRⅠ购自 Takara 公司；DNA Makers：10