IPTG诱导蛋白表达的原理和方法步骤.docVIP

IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤 E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达 。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。 材料 1、诱导表达材料 ( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基 酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g NaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2% 蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0 适用范围：大肠杆菌 ( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃ 保存。 ( 3 ) l× 凝胶电泳加样缓冲液： 50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 ) 50 mmol / L DTT 2 % SDS （电泳级） 0.1 ％ 溴酚蓝 10 ％ 甘油 2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料 1 ）酶溶法 （1）裂解缓冲液： 50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 ) 1 mmol / L EDTA 100 mmol / LNaCI （2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。 （3）10 mg / mL 溶菌酶。 （4）脱氧胆酸。 （5）1 mg / mL DNase I。 2 ）超声破碎法 ( 1 ) TE 缓冲液。 ( 2 ) 2×SDS 凝胶电泳加样缓冲液： 100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 ) 100 mmol / L DTT 4 %SDS 0.2 ％ 溴酚蓝 20 ％ 甘油 实验方案 1、外源基因的诱导表达 ( 1 ）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。 ( 2 ）按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到相应的宿主菌。 ( 3 ）筛选出含重组子的转化菌落，提取质粒DNA 作限制性内切核酸酶图谱，DNA 序列测定， 确定无误后进行下一步。 ( 4 ）如果表达载体的原核启动子为PL 启动子，则在30 -32 ℃ 培养数小时，使培养液的OD600达0.4-0.6 ，迅速使温度升至42 ℃ 继续培养3 -5h ；如果表达载体的原核启动子为tac 等，则37 ℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG 至终浓度为1 mmol / L。继续培养3 -5h 。 ( 5 ）取上述培养液1 mL , 1000g 离心，1 min ，沉淀，加100 μL 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后，作SDS 检测。 2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化 1 ）细菌的裂解 常用方法有：① 高温珠磨法；② 高压匀浆；③ 超声破碎法；④ 酶溶法；⑤ 化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方法① 、② 已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。 （1）酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；壳多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。主要步骤为： ① 4 ℃ ，5000rpm 离心，15 min ，收集诱导表达的细菌培养液（100 mL ）。弃上清，约每克湿菌加3 mL 裂解缓冲液，悬浮沉淀。