肠道病毒71型2C蛋白原核表达及抗体制备.pdfVIP

10 微生物学杂志 2014年12月第34卷第6期 JOURNALOFMICROBIOLOGYDec．2014Vo1．34No．6 肠道病毒71型2C蛋白原核表达及抗体制备 郑方亮 ，王 励 ，于 亮 ，郑振华 ，郑才尚 ，刘宏生 (1．辽宁大学 生命科学学院，辽宁沈阳 110036；2．中国科学院武汉病毒研究所 病毒学国家重点实验室，湖北 武汉 430071) 摘 要 肠道病毒71型(EV71)的非结构蛋白2c(P2C)在病毒复制周期中起着重要的作用，制备P2C的特异 性抗体，对研究P2C的生物学功能以及EV71与宿主相互作用的具体机制有非常重要的意义。实验将 2c基 因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上 ，在大肠埃希茵BL21(DE3)中表达出重组蛋白rP2C，进一步优化原核 表达条件，在温度为30℃，诱导剂IPTG浓度为 1mmol／L时，蛋白表达量最高，且主要以包涵体形式存在。直 接将获得的rP2C通过 SDS分离后免疫新西兰兔，制备 EV71病毒 P2C的兔多克隆抗体。通过Western blot检测，该抗体在 1：10000稀释比例下仍能很好地识别原核表达的rP2C。同时该抗体也能很好地检测到 EV71感染RD细胞中的P2C。因此，实验制备出的抗P2C抗体特异性强、效价高，为后续P2C功能的研究以 及EV71病毒检测提供了良好的材料。 关键词 EV71病毒；2C蛋白；原核表达；多克隆抗体 中图分类号 Q78；R373．2 文献标识码 A 文章编号 1005—7021(2014)06—0010—05 doi：10．3969／j．issn．1005—7021．2014．06．002 ProkaryoticExpressionandAntibodyPreparation ofEnterovirusType71Pr0tein2C ZHENG Fang-liang ，WANG Li，YU Liang ，ZHENG Zhen—hua ， ZHENG Caishang ．LIU Hongsheng (1．Col1．ofLifeSci．LiaoningUni．，Shenyang110036； 2．StateKeyLab．ofViro1．，WuhanInst．ofViro1．，ChinaAcad．ofSci．，wuhan430071) Abstract Nonstructuralprotein2C (P2C)ofEnterovirus71(EV71)playsanimportantroleinviralduplicationcy— cle．PreparationofP2C specificantibodyhasveryimportantsignificancetostudythebiologicalfunctionofP2C and interactionmechanism betweenEW 1anditshost．The2CgenewasclonedintotheprokaryotieexpressionvectorpET一 28a(-I-)．TherecombinantP2CwasexpressedinE coliB【21withtheplasmidpET28a2C．Afteroptimizationitwas comfirmedthatunder30oC andinducerconcentrationat1m mol／LIPrI、G．theexprssionofP2Creachedtothehigh． estandmainlyexistedinaform ofinclusionbody．TheobtainedP2CwasimmunizedintoNewZealandwhiterabbits aftersepratatedbySDS—PAGE andpreparepolyclonalantibody．Itwastestedthroughwesternblotthattheantibody stillcouldbewellide