鸭源pkcimirna表达载体de构建及鉴定.pdfVIP

贵州农业科学 2O14，42(4)：148～151 GuizhouAgriculturalSciences [文章编号2014)04—0221—0148—04 AnimalHusbandry ·Veterinary ·Fishery ·Silkworm 鸭源 PKCImiRNA表达载体的构建及鉴定 熊朝丽 ，赵 碧 ，周碧君 ，王开功 ，程振涛 ，文 明 (1．贵州大学 动物科学学院，贵阳贵州 550025；2．贵州省动物疫病研究室，贵阳 贵州 550025) [摘 要]为给蛋 白激酶c抑制蛋 白(PKCI)在鸭肠炎病毒增殖的作用机制奠定基础 ，根据 PKCI基 因 mRNA序列及 miRNA设计原则，合成 4对 miRNA 寡聚单链 DNA，退火成双链 dsDNA，用载体构建试剂 盒进行重组质粒构建，插入miRNA表达载体 (pcDNA 6．2-GW ／EmGFPmiR)构建表达质粒，转化至感受 态细胞 DH5a，筛选并提取重组质粒进行测序分析 。结果表明：在含壮观霉素的 LB平板可生长 出含 目的基 因的重组细菌菌落；测序表明成功构建 了鸭源PKCI基 因miRNA表达载体 ，重组质粒 pSilencer—PKCI一1～ pSilencer—PKCI一4的插入部分大小为 7l～134bp、68～131bp、68～13Obp和 68～l31bp；重组质粒 miRNA 有鼠类 miR一155骨架结构，即左侧为天然miR一155结构 ，右边为发卡结构的末端环 区(internalloop)和配对 区域 内部 的末端环 区miRNA 结构 。 [关键词]蛋 白激酶C抑制蛋白；鸭肠炎病毒核衣壳蛋 白；靶 向小分子干扰 RNA；裁体构建 [中图分类号]Q784 [文献标识码]A Constructionand Ident…catiOnofDuck PKClmiRNA RecombinantPlasmid XIONGChaoli，ZHAOBi，ZHOUBijun～，WANGKaigong ，CHENGZhentao～，WENMing · (1．CollegeofAnimalScience，GuizhouUniversity，Guiyang，Guizhou550025；2．GuiyangInstituteofAnimal Disease，Guiyang，Guizhou550025，China) Abstract：In ordertoprovidethebasisofthePKCIduck enteritisvirusproliferation mechanism ， accordingtothemRNA sequencesofPKCIanddesignprinciplesofmiRNA 。fourpairssingle—strandDNA ofmiRNA weredesignedand synthesizedannealing into double—strandDNA．Thefourpairsofdouble— strandDNA ofthemiRNAwereinsertedintomiRNA expressionvectorpcDNA 6．2-GW ／EraGFPmiRto constructmiRNA expression plasmid with vector construction kit， and transfected the recombinant plasmidintothecompetentEscherichiacoli．DH5a．Afterselecting positiveEscherichiacoli．DH5a，and extractingtherecombinantplasmids，thesequencesoftherecombinantplasmidswerefinallyidentificated． Results：Recombinantbacterialcoloniescontaining thedesiredgenemaybegrown in thespectinomycin containing IB plate：Taken recombinant bacteria were cultured and extra