一种氨基甲酸乙酯与尿素降解酶产生菌的鉴定及酶学特性.pdfVIP

!l !■●■!Ⅲ !■ 一! 氨基 甲酸 乙酯 (EthylCarbamate，简称 EC)，又 1．1．2 培养基 富集培养基(组分 L)：葡萄糖2， 称尿烷 (Urethane)早在 1943年 ，Nettleshipt】等进行 EC2，磷酸二氢钾 2，乙酸钠 2，氯化钠 5；调节 pH 的动物实验就证明EC具有潜在的致癌性 。基因毒 5．0。115 灭菌 20min。 性和致癌性测试显示 EC是主要食源性致癌物质[2-3]。 种子培养基 (组分 g／L)：葡萄糖 20，蛋 白胨 10， EC广泛存在于发酵食 品(如酱油 、腐乳)和饮 牛肉膏 10，酵母膏 5，氯化钠 5，磷酸氢二钾 2，乙酸 料酒 中(如黄酒 、清酒)及蒸馏酒 中(如 白兰地 、威士 钠 2，EC2；调节pH7．0。115℃灭菌 15min。 忌等)中 。 自从 1985年 12月加拿大的卫生与福 发酵培养基 (组分 g／L)：葡萄糖 2O，蛋白胨 1O， 利组织 (CanadianDepartmentofHealthandWelfare) 牛 肉膏 5，酵母膏 5，KH2PO42，NaC15，NaAc2，尿 首先规定各类酒 中的EC含量 ．日本酒行业也表示 素 2，四水硫酸锰 O．05，六水硫酸镍 0．05；pH5．5(用 加强食 品安全 的检测 ．并把清酒和我国生产的黄酒 3O％HC1调 pH)。115oC灭菌 20min。 加入限制的行列 ，要求我国黄酒 的EC质量浓度必 LB培养基(组分 g／L)：胰蛋 白胨 10，NaCl10， 须低于 100 g门L，因此这就极大地限制了我 国的绍 酵母膏 5；pH7．0，121℃灭菌 20min。 兴黄酒出 口日本和东南亚国家 。 1．1．3 主要试剂 细菌基 因组 DNA抽提试剂盒 ： 对 EC形成机制的研究表明，酒精饮料 中9O％ 上海生工生物工程公司；DNA标准相对分子质量 、 以上的EC是来源于酒 中的尿素和乙醇 的化学反 DNA胶 回收试剂盒 、琼脂糖、PfimeSTARmaxDNA 应8[-9]，因此对于黄酒中EC的控制可分为两个方面， 聚合酶 ：大连 TaKaRa公司；分子级的酵母粉、蛋 白 一 种是直接降解黄酒中已经形成的EC，另一种是 胨 ：英 国Oxoid公司；其他试剂 ：国产分析纯。 通过 向后酵酒中添加酸性脲酶。将 EC的前体物质 1．2 主要仪器与设备 尿素分解为 CO2、HO和 NH3，从而减少 EC的进一 722光栅分光光度计 ：上海第三分析仪器厂产 步形成 。 目前研究者主要致力于第二个方面 的研 品：超声波细胞粉碎机 ：宁波新芝生物技术股份有 究，即通过筛选产酸性脲酶的微生物来控制黄酒中 限公司产 品；电热恒温水浴锅 ：上海医疗器械五厂 的EC，国内吴伟祥 ，刘颖等 0【1从污泥 中筛选到产酸 产 品：5804R台式高速冷冻离心机 、5424高速离心 性脲酶的菌株 ，并研究了产酶条件 ；田亚平 ，王松华 机 ：德国Eppendoff公司产 品；BioRadl000系列高性 等 l1『2】筛选到一株能产酸性脲酶的肠杆菌．并将该 能 PCR仪 、核酸电泳仪 、蛋白质电泳系统、GelDoc 酸性脲酶应用于实际黄酒环境中，能够降解 70％以 凝胶成像系统：美国Bio—Rad公司产品。 上 的尿素 ；江南大学 的刘俊等r13J结合脲酶对尿素的 1．3 实验方法 降解和功能性材料对 EC的吸附作用，首次建立了 1．3．1 EC降解酶产生茵的筛选 初筛 ：在超净 台 从底物到产物对黄酒 中EC含量的集成控制策略； 中取 2g小鼠胃容物 ，加入到 以EC为惟一氮源的 田亚平 ，谷晓蕾 4【1筛选到了一株产氨基 甲酸乙酯降 富集培养基 中，置于摇床上 ，37oC、200r／min振荡培 解酶的变幻青霉并