未脱钙耳蜗组织树脂包埋与切片方法.pdfVIP

· 1142 · 临床与实验病理学杂志 JClinExpPathol2013Oct；29(10) 未脱钙耳蜗组织树脂包埋与切片方法 张文丽，李 倩，郭 静，王瑞敏，杨 方，田发明，刘业民 关键词：未脱钙；耳蜗；树脂包埋 镜下用 2ml注射器经圆窗灌注预冷的2．5％戊二醛固定液， 中图分类号：R329—33 文献标志码：B 固定液经 由圆窗达蜗顶部流出，灌注数次后将组织浸入 文章编号：1001—7399(2013)10—1142—02 2．5％戊二醛固定液中，放入4℃冰箱内固定4h或更久。 1．2．2 环氧树脂 Epon混合 包埋 剂配制 将环 氧树脂 耳蜗是一螺旋形骨管，与外壁的螺旋韧带相连，含有弹 Epon812(2．5m1)、环氧树脂 Epon815(2．5m1)、DDSA(9 性纤维基膜、蜗轴的骨螺旋板等骨质结构。传统的制样方法 m1)、DMP一30(0．15m1)逐项加入20ml量杯中，混合后充分 是对耳蜗组织进行逐级脱钙 ，但脱钙的样品制备操作费 搅拌30rain，混匀后静置20min，排除气泡，至包埋剂清亮透 时，难度较大，脱钙后组织成分有部分丢失，超微结构受到不 明，封 口膜封 口待用。 同程度的损伤，尤其会导致膜性结构病理假象 ，给耳蜗样品 1．2．3 耳蜗 包埋处理 耳蜗用 1％四氧化锇再次固定 2．5 观察带来困难。一些学者对未脱钙骨的制作技术进行改 h，然后梯度乙醇脱水 (浓度分别为50％、70％、90％、95％、 进 ，但对未脱钙耳蜗电镜技术探讨较少。本文在传统透 100％)，再用 1：1液 (即 100％无水丙酮 ：100％无水乙醇) 射电镜样品制备基础上进行改进 ，省去脱钙操作步骤，采用 脱水2次 ，标本在每级浓度内停留 15～20min。梯度浸透 未脱钙方法，以多聚甲醛与戊二醛的混合液灌注固定大鼠， 法，用环氧树脂Epon混合包埋剂与丙酮 1：1、2：1浓度各 增强固定液在耳蜗的渗透力 ，保证 良好固定 ；用环氧树脂 浸透样品2h。将耳蜗标本置人洁净干燥 、一头尖的硅胶包 Epon混合包埋剂梯度浸透包埋 、钻石刀连续大切片方法，取 埋平板内，纵向包埋入纯包埋剂中包埋聚合。温箱 中聚合 得较为满意的效果，现介绍如下。 37 ℃ 12h、60℃ 24h。 1．2．4 切片及染色 先用单面刀片修掉耳蜗周围多余包埋 1 材料与方法 剂，修出梯形组织面，将修整好的组织包埋块 固定在 Leica UC6超薄切片机上 ，选用宽刃3．5mm45。角的钻石刀，先手 1．1 主要试剂和仪器 缓冲液：磷酸氢二钠、磷酸二氢钠。 动切片，200～300nm厚连续切片 3—4张，然后调整到 自动 调节 pH值 ：氢氧化钠。固定剂 ：4％多聚甲醛、2．5％戊二 切片，70～80nm厚，选灰白或淡黄色薄厚均匀的切片，为防 醛、1％四氧化锇。脱水剂：乙醇、丙酮。环氧树脂Epon815、 切片卷 曲或皱褶，镜下用三氯 甲烷展片；再用带膜铜网捞取 812包埋剂、DDSA(十二烷基琥珀酸酐)、DMP一30(加速剂) 2—3张大的切片，经醋酸双氧铀、枸橼酸铅双重染色，透射 (日本和光纯药工业株式会社)。LeicaUC6超薄切片机 (德 电镜观察、拍照。 国Leica奥地利分公司)、H-7650透射电镜 (日本 日立公 司)、CCD照相机 (