重组人clk1de真核表达及鉴定.pdfVIP

技 术 通 讯 v1 LETTERSINBIOTECHNOLOGY Vo1．．2厶5)Nlo。．4斗·JuuI．，2014 455 TT doi：10．3969~．issn．1009—0002．2014．04．002 研究报告 重组人CLK1的真核表达及鉴定 李超 ，祖勉 ，连雯雯 ，刘艾林 一，杜冠华 。 1．中国医学科学院北京协和医学院 药物研究所；2．天然药物活性物质与功能国家重点实验室； 3．药物靶点研究与新药筛选北京市重点实验室；北京 100050 [摘要] 目的：合成真核细胞CLK1(Cdc2一likekinase1)编码基因，构建cLK1／pEGFP—N2真核表达载体并在真核细 胞HEK293A中过表达，为CLK1的生物学功能研究奠定基础。方法：从人脐静脉血管内皮细胞中提取总RNA，采用 RT—PCR技术用 已知引物合成cDNA，将CLK1基因扩增后插入真核细胞表达载体pEGFP-N2，将重组质粒热转化至 大肠杆菌感受态Trans10细胞 中获得重组菌株，提取质粒进行酶切鉴定及插入基因测序；将构建的重组质粒转染 HEK293A细胞 ，用Western印迹及免疫荧光检测CLK1的表达水平，同时对其下游的磷酸化SF ASF蛋白进行检测。 结果：构建 了CLK1／pEGFP—N2真核表达载体 ，将其转染HEK293A细胞后24h，CLK1蛋白表达水平最高；同时，CLK1 过表达后使得下游的SF2／ASF蛋 白磷酸化水平升高。结论：构建了人CLK1基因的真核细胞表达载体CLK1p／EGFP— N2，并在HEK293A细胞中过表达，其生物活性也得到了验证。本研究为外源性CLK1基因在真核细胞 中过表达提供 了一种途径，为CLKI的生物学功能研究奠定了基础，也可为真核细胞其他蛋白表达体系的构建提供借鉴。 [关键词] Cde2一likekinase1；真核表达；重组质粒 [中图分类号] Q78 [文献标识码】 A [文章编号] 1o09—0002(20l4)O4—0455—05 Eukaryotic Expression and Identification of Recombinant Homo CLK1 L／Chao，ZU Mian，LIAN Wen-Wen，LIU Ai—Lin。，DU Guan—Hun。：l= 1．Institute of Materia Mediea．Chinese Academy ofMedicalSciences ＆ Peking Union MedicalCollege；2．State KeyLaboratoryofNaturalActiveSubstancesandFunctions；3．BeijingKeyLaboratory ofDrugTargetResearch andDurgScreening；Beijing100050，China Co—correspondingauthors，LIU Ai—Lin，E—mail：liuailin@imm．ac．cn；DU Guan—Hua，E—mail：dugh@imm．ae．cn [Abstract】Objective：ToinvestigatesynthesisofthegenesequenceencodingeukaryotieCdc2一likekinase 1 (CLK1)。constructionoftheeukaryoticvectorsCLK1／pEGFP—N2 and itsover—expression inHEK293A ceils．This work providesguideline forresearch in CLK1biologicalfunction．M ethods：TotalRNA was extracted from human umbilicalvein endothelialcells．The CLK1genewas amplified by RT-PCR．and then wasinserted reversely into the eukaryotie expre