5多糖分子量测定.pptVIP

多糖的分子量测定是研究多糖性质的一项较为重要的工作。多糖的性质往往与它的分子量大小有关。例如，多糖溶液的粘度不但随浓度的增大而升高，而且与多糖分子量大小有关。一般说来，分子量增大，粘度增高。 在生物学研究中，发现某些多糖由于分子量大小方面的差别，所产生的某些效应也有一定差异。 由于不同分子量大小的多糖具有不同的性质，在多糖的应用中，如以其作为试剂使用于某些实验时，往往需要在它的分子量大小方面作选择。可见,不论在多糖性质的研究，或是在它的用途等方面，都涉及分子量方面的问题，往往需要测定它的分子量。因而测定分子量成为研究和制备多糖的一项经常性工作。 测定多糖分子量时，为了避免因存在杂质而影响测定结果，需要把检测的样品(简称样品或检样)适当提纯。用于分子量测定的样品，纯度要求虽然不十分高，但至少要达到 : (1)去除杂质和水分。 (2)把不同化学结构的组分相互分开，使它们在测定分子量中不相互干扰。 (3)把不同分子量大小的组分相互分开。 另外,在用某些方法进行分子量测定时，需要先将小分子量的盐和单糖除去。 一、渗透压法： 利用膜渗透压计(Membrane Osmometer，简称MO仪)可以测定范围在1万～50万之间的多糖分子量。本法不需用标准品. [原理]:把多糖水溶液装在半透膜制成的透析袋内，袋外为溶剂(水)，水分子可以自由通过半透膜，多糖分子则不能通过透析膜，因此袋内的多糖分子必将吸引更多的水分子渗入袋内，形成一定的渗透压。渗透压与溶液中的溶质分子数有关，可以用范特荷甫公式表示，即 πV=nRT (1-1) 式中π——渗透压； V——溶液体积； n——溶液摩尔数； R——气体常数； T——绝对温度。 因 n=W/M， W=CV, 代人上式简化后得: M=RT/(π/C ) (1—2) C:浓度 有些研究者认为应当考虑溶剂在不同温度时的密度D，即 M=RT/(π/c*D) (1—3) D:密度 [仪器和试剂] 本试验采用的膜渗透压计为德国Knauer公司的膜渗透仪. 与该公司特制的专为测定水溶性物质用的双层膜作为半透膜, 溶剂为脱气蒸馏水。 膜渗透仪的主要部件是渗透池,由半透膜分隔成上下两池,下池底部中央有一压敏换能元件。操作时先将下池充满纯水，加上半膜后再将上池充满测定的溶液。在恒温条件下使两池达成平衡，压力之差由换能器输出信号放大后记录，求得π值. 膜渗透压计示意图 [操作] 以右旋糖酐分子量的测定为例。 (1)仪器准备：将脱气后的蒸馏水充满下池。浸泡好的半透膜覆盖其上并注意勿使气泡进入。将上池压紧。按操作要求逐步旋紧中心螺丝(约8小时)，装上针阀及校正杯进行仪器校正(约12小时)，取下针形阀及校正杯，装上进样管，用溶剂充分冲洗后，开动记录仪，划出基线(约12小时)。 (2)样品准备：每一测定的样品需配3～5个不同浓度的溶液。本试验中用右旋糖酐配制成 O.209 g／100 mL(C1)，O.403 g／100 mL(C2)及O.626 g／lOO mL(C3)3种浓度的溶液。 (3)样品测定：先用浓度为C1的样品由进样管注入上池，清洗3次，再注满进行测量，直到记录仪达到平衡。划出的直线与基线之间的距离即为该浓度溶液的π值。 同法测定C2，C3溶液的π值。 第六章 多糖的分子量测定 (4)分子量计算： R—气体常数（848） T—绝对温度 π—渗透压 D—密度 二、端基法 [原理]测定单位重量样品中所含可测端基之数，计算检样的分子量. 例如,对某一种多糖的分子结构，业已明确知道它每一个分子链含有一个可测端基和每毫克中所含的可测端基为A mmol，那么，该多糖的分子量应该是1／A。 可见检样的分子量,是它每毫克重量中所含可测端基的毫摩尔数的倒数，在端基法测定分子量时，分子量计算的通式为: 检样重量mg／可测端基(mmol)=检样的分子量(Mn) 用端基法测分子量要求检样的化学结构须具备如下两个条件： (1)每一个分子链端须具有可以用化学方法作分析的基团，以便采用一定的定量分析方法，对该端基作定量分析。 (2)检样的每一个分子链，它所含可测端基的数目，不但须明确，而且数目应固定不变。 下面介绍几种常用的测定多糖还原端基的定量分析方法: 3，5一二硝基水杨酸比色法 本方法在还原糖与3，5一二硝基水杨酸反应时，产生颜色。测定