HCVNS4基因在大肠杆菌中表达和蛋白质提纯.pdfVIP

维普资讯 第 7‘卷 第 4期 武}叉大学学报 (理学版 V0l47 No 1 2001年 8月 J WuhanU ：】Iv (Nat．Sci Ed．) AuF．2001468～ 470 文章编号2001)。4。6‘803 HCVNS4基因在大肠杆菌中表达及蛋 白质提纯 王晓玲 ， 林拍 ，部金荧，豫进平，吴正辉 t武汉大学 病毒研究所，湖北 武汉 430072) 摘 要 ：应用 PCR方法扩增 出人丙 肝炎病毒全I=乇NS4基医的DNA 段 ．克隆^袭达载件 pQE32并转化 EcoliJM109．经IPTG诱导表达 出42×10蠹 白 利 Ni—NTA—agarose纯化得到纯化产物 ，West㈨．bl0t箍定该 蛋白能够与抗 NS4 单克隆抗体发生特异 反应 关 键 词 ：丙爱肝炎病毒 ：NS4蛋白：表达 ：纯化 中圈分类号：Q 78 文献标识码 ：A 丙型肝炎病毒 (HCV)于 l989年波首次分 基因的质粒 pBlueBac25及大脑杆菌 DHj、JM]09 离l】j，它是 引起全球约 70％非甲非乙型肝炎的主要 为本室保存 ．克隆有 NS4单克隆抗体基田的质粒 病 原 困子 ．HCV 属 于 黄病 毒科．基 组 为止链 E6FAB及其宿主大脑坪莆菌株 HBg]5l、碱}生磷酸 RNA，全长 9．5kh，只有一个开放阅读框 ，编码…个 酶标记的山羊抗人IgO抗体 由P．Gallinari教授惠 约3000个氯基酸 的聚蛋 白前体 ．基 固组5和3两 赠 ．pUCmT载体购 自华美公司 ．各种限制眭内切 恻各有一个非翻译 区(Untranslatedregion，UTR)． 酶 、T4DNA连接酶 、Taq酶为 Prolnega、GIB(O 聚蛋白前体在宿主及病毒 自身蛋 白酶的作用下．梭 BRI、Biostar公司及上海生工公司产品 N 金属离 切割产生多种功能蛋白，包括结构蛋白：核衣壳蛋白 子鳌台层析蛙为Invitrogen公司产品． Core，囊膜糖蛋 自El和 E2．以及非结构蛋 白P7、 12 方 法 NS2、NS3、NS4A、NS4B、NSjA和 NS5B一． l2．1 PCR扩增 NS4蛋 白可以在_NS3蚩 白酶作用下水群产生 根据 已公开报道的人丙型肝炎病毒 HCV核酸 NS4A、NS4B．大小分别是 8×l0。和 27xl03l．现 序列，设计丁一对引物，Pl：5GGTACCAAGCTT 有资料表明NS,IA可 以和 NS3蛋 白结合促进 NS3 CTA TATCCA GTCC 3 ‘：P2．5GAG CTCGGA 的蛋白酶活性n]，这种结合是否有另外的生物学意 TCCATA CGCTGCA(( (2-3 ．以质粒 pBlue 义还需探讨 ．另外 NS4相对于其他非结构蛋 白在 Bac25为摸板进行PCR循环：94。Clrain，记 。(、l 病毒进化上较为保守，是 HCV三代诊断试剂盒中 min，72C1．5m[n．30个循环后 72。C延伸 7min． 的主要抗原 ，最近研究发现 NS4蛋 白上有 2个主要 12．2 NS4的克隆及表达载体pQENS4竹掏建 的强抗原袭位- 成功地克隆、表达了垒壬的NS4 按照华美公司T载体使用说明书进行 ．经过 基因，通过柱层析获得纯化的NS4蛋白．为深八开 篮白斑筛选出白色菌落 ，碱裂解提取质粒 ，酶剀鉴定 展对 NS4的生物功能研究奠定了坚实基砌 ． 阳}生克隆 ．瞩低熔 晾脂糖 回收B“”H I和 Hid Ⅲ双酶切小片段．即全长NS4基因，插^载体质粒 1 材料与方法