耳霉属真菌耐热性高活力碱性蛋白酶.pdfVIP

； q ／， 耳霉属真菌耐热性高活力碱性蛋 白酶 S．H．BHOSALE等 魄 一 、 前 言 蛋 白蘸是三种高价值商品之一，另外两种是淀粉葡萄糖苷酶和葡萄糖异构酶．它们应 用于食品、医药和洗涤剂工业 。还是研究蛋 白质和多肽结构的重要工具．在高pH和温度 下具有活性和稳定性的蛋 白酶适合生物技术的应用。嗜热微生物的酶对热稳定，但在高 pH 下不稳定，相反嗜碱 微生物的酶类 在碱性范围内稳定，在较高温度 F却非常不稳定． 在我们实验室从耳霉属真 菌(ConidiobolusNCL82．1．1)中分离出的碱性蛋 白酶能代替枯草 杆菌素拆分氨基酸外消旋混合物，还是胰蛋 白酶的代用品用于制备动物细胞培养物 。耳霉 属真菌能产生高水平的碱性蛋 白酶活力(30u／mt)。证明该祷包含在释放孢予的调节机制 中，通过 自溶形成低活力蛋 白酶．还证明该碱性蛋白酶显示出宽阔的底物专一性，能与常 用的洗涤剂相适应 。这表明它在洗涤剂工业具有潜在的应用价值 。然而，评价某种酶制荆 的稳定性，一个重要因素是该酶对大范围洗涤过程温度所具有相适合的稳定性．使用某些 方法防止蛋 白质遇热变性，包括采用二硫键化学修饰或交联，及位点特异性突变．我们当 前工作的 目的是改善耳霹属 菌碱性蛋 白酶的热稳定性，增加作为洗涤剂添加物 的效率。 本文研究了化 台物配伍对蛋白酶热稳定性的影响．我们的结果显示 出Ca2+和甘氨酸有效 地防止热失活，能增加耳霉属真菌蛋 白酶的热稳定性。 二 、材料和方法 (一 )材 料 麦芽汁，酵母膏，蛋 白胨和琼脂 由Difco实验室提供．甘油、D一葡萄糖、NaCI和尿 素由本国购买 。山梨醇和 PEG一8000由本国购买．乙二醇、琉基 乙醇和十二烷基磺酸钠 (sDs)由sigma化学公司获得。酪蛋 白购 自德 国．所使用其它全都化学试剂均为商品化高 纯化 学试 剂． (二)菌 种 耳霉属真菌(conidioboluscronatlls)在 MGYP琼脂斜面 28E保存。(麦芽汁 O．3％， 葡萄糖 1．0％，酵母膏O3％，蛋 白胨 O5％，琼脂2％)， (三)酶的生成 将耳霉属真菌斜面接人装有 100rnl最适发酵培养基的三角瓶中．(蔗糖 3％，硝酸铵 0．38％，蛋 白胨 2％t氯化钾 0．2％，磷酸二氢钾 0．1％，酪蛋 白2％，硫酸锌 0．001％，氯 化钙 0．001％)．终 pH7．0_-7．5，该培养物按 10％接种量转接到 100m]相同发酵培养基 中．试验摇瓶在 28℃，220转培养 48小时，过滤分离发酵液 中的菌体和不溶性碎片．使 用滤出物作为酶源 ． (四)酶的分析 按照前报描述方法测定蛋 白酶活力．2ml混合反应物吉有 O2M碳酸钾一碳酸氢钾缓 冲液配制的酪蛋 白 10mg，pH9．7，适 当稀释的酶液 ，在 37C，保温 l0分钟 ．添加 3m15％三氯醋酸 中止反应，用过滤方法除去沉淀后，用分光光度计在 280nm测定酸溶解 一 38— 性物质． 爵活单位定义是，在 37℃，每分钟使反应混合物增加 1．0Amr]，所需的酶量为 l皿 厂。 ． 伍 ’热稳定性的研究 将 5个单位酶置于O．2M 碳酸钾一碳酸氢钾缓冲液中pH9．7．考察耳霉属真菌蛋 白酶 舶热失活．在螽加剂存在下，以所要求温度和时间周期 内保温酶的方法考察添加剂对热稳 定性的影响．保温终了酶置于球浴玲却 15分钟，测定残余活力．在缺少添加剂时，酶在 412保温的活力作为对照，假设该活力为 100％．以2单位酶和不同的洗涤剂(7ragml) 和 cacI(25mM)在 5012保温 1小时测定残余酶活力的方法考察洗涤剂存在下酶 的稳定 性．