人TNF2αmRNA实时荧光定量PCR检测标准构建①.pdfVIP

α 郑晓群等　人 TNF mRNA 实时荧光定量 PCR 检测标准的构建　第 11 期 7·83 · ① 人 TNFαmRNA 实时荧光定量 PCR 检测标准的构建 ② ② ( ) 郑晓群 　邹立林 　吕建新 　 温州医学院附属二院 ,温州 325027 　　中国图书分类号 　R39211 　　文献标识码 　A 　　文章编号 　1000484X( 2004) α α [摘 　要] 　目的 :克隆人 TNF cDNA ,作为人 TNF mRNA 定量检测的标准品。方法 :用 RTPCR 法从人外周血单个核细 α α α 胞的总 mRNA 中逆转录扩增 TNF 的cDNA ,将纯化的 TNF cDNA 与pUCmT 载体进行连接 ,转化宿主菌 DH5 ,然后提取重组 质粒 DNA ,用限制性核酸内切酶 Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ进行双酶切鉴定并测序分析,最后对质粒标准进行实时荧光定量 PCR 检测。 λ 用聚乙二醇沉淀法纯化质粒并检测 260 nm 吸光度 ,确定原液的重组质粒拷贝浓度并以此制备荧光定量 PCR 梯度浓度标准 α α 品。结果 :酶切鉴定、PCR 扩增及测序分析均证实 TNF cDNA 重组到 pUCmT 载体上。结论 :成功克隆了 TNF 实时荧光 PCR 定量标准。 α [ 关键词] 　肿瘤坏死因子 ;核糖核酸 ,信使 ;逆转录聚合酶链反应 ;TA 克隆 Construction of the standards for detecting human TNFαmRNA with realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction ZHENG XiaoQun , ZOU LiLin ,L JianXin . The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College , Wenzhou 325027 , China ; School of Laboratory Medicine and Public Health , Wenzhou Medical College , Wenzhou 325027 , China α α [ Abstract ] 　Objective :Cloning human TNF cDNA and using it as the standard for realtime quantifying TNF mRNA. Methods :Hu man peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from whole blood by FicollHypaque density gradient centrifugation. Total RNA α extracted from the PBMC by acid guan