肺炎链球菌补体结合蛋白(C3-BP)的纯化及免疫学效果初步探讨.pdfVIP

Fn十I|CI(O5M 0缓冲液冼杜．吼禽20％见目的蛋白禽螫有明显的差异．放确定以三氯醋酸 NaCI)，plt7 乙醇的n…HCINaCI埋iIlI液洗脱，分部收集，波长(TCA)沉淀法作为上清中蛋白沉淀的方法。 280tm b检测二10％SIPS—PAGE、C3结合宴验(Weslem ——1～ B[oltiltg)检定 s．C3-BP检定：蛋Fl裔垃洲定使用kwH法一分 ：_{：；_墨：- “ r城测定使用10％5DS(还原蜊与非还原喇) ““1u■● 蛋白定性使用W岛tem Bh“tlng：利用c3一BP可以与补 -…■- 阵c3结合的特性，以补体c3作为第·抗体．孵育后 肋人世抗人抗c3抗体．最后加人辣报过轼化物瞬 (HRP)标记的兔抗羊I鲋抗体．以伽B作为底物显 色，即三步捡测法：沁((3-叶)一Abl(C3)一Ab2 _一 J茹) (抗C3抗体)一AM(HRP 6．9V型c}BP保护效果观察：攻卅茼株uk 测定：待测菌种为肺炎链球阐2型、6B型、9v硎、14 喇19F型，将薷培养24小时后传毫克氏瓶弘扳吲 体培养基．继续培养10小时后，将菌瞢刮至PBS内， 阳矿 每个血请型的菌液做4个稀释度．攻山苗液置于球 梧中3小时内攻击小鼠完毕、活蒲计教：将最低稀 释度的攻击蔺液稀释至适宜浓度．取041rd接种于 血乎肌中，计算其CFU。抗血清滴腰的测定(酶联免 -．． 疫啦附试验)：抗原包敞：姐为9V蘸涟(20亿／m1) 以05％甲醛坂活．用包被缓冲液稀释成8十稀释度 (倍比稀释)．每孔100山．4℃过夜二辫一组为∞．BP 结集 包被．每iL100pJ．蛋白浓度lOHg／ml作为包被抗昧； 封闭：一扰为免疫啦清(1：10—1：20480)，空白孔只 加牟血清．阴性对照加AI(OH)佐剂免疫的小鼠血 Igc) 清；i抗为HRP标记的羊抗鼠蛔G酶标抗体。鼹色 测定：．A450皿测定暇光值。 7．C3-BP细胞免疫效果初步研究：小鼠脾淋巴 细胞增值实验：取牵自纽、|{Ij性对照组、10『罐c3-BP 免疫组NIH小鼠各10只，雌雄备半；解削小鼠取脾 脏和胸腺，混合．研磨．加淋巴细胞分离液．离心．加 入含10％NCS的P,PMI．1640培养基，细胞计数．稀 释。将细胞是液加^24孔板．各组分别设4哑组 ((=0以．IPS、明性对照组．窄白组)，每蛾设3个复孔． 细胞于37℃、5％C02孵箱培育72h．终止培育前4h j‘各扎加AM丁rf摩唑蓝)．492唧搜长测定波长值。 p吼dⅡintI_哼畔9V 计算方法：刺激指数(SI)=免症纽被长值均数删性 M№dⅡlm％№rhs【Ⅻ训are“lm 对照组渡长值均效。 山}利3可见．培养上清中未经纯化的蛋白混台 结 果 物与纯化后的扑体结合蛋内WB检测均显示为一1、 条带．表明a．BP具有与补体c3结台的特性．经过 1．上清中蛋白沉淀方法的选择：盐析条件摸索 抗c3抗体和酶标=抗显色町“显示出来；同时电排 中发现．20％副80％乖fIj】饱和度硫酸铰盐析后产物 的10％SDS纯度分析及Westernblot删定，未除了培养牡中其它蛋白成分与补体。结台的可能