家蚕微孢子虫荧光定量PCR检测方法及诊断试剂盒.pdfVIP

第四届中国兽药大会——兽医微生物学、兽医生物制品学学术论坛论文集(2012年) 家蚕微孢子虫荧光定量PCR检测方法及诊断试剂盒 何永强1，吴姗1，鲁兴萌2，张弘3，邱海洪2，帅江冰1， 强1 王素华1，张晓峰1，徐国群1，李光才2，董 0029； (1．浙江出入境检验检疫局技术中心，杭州310012；2．浙江大学动物科学学院，杭州31 3．浙江中医药大学第一附属医院，杭州310006) 摘要：基于为蚕种生产与流通贸易提供快速、灵敏、准确检测家蚕微孢子虫方法的目的，以家蚕微孢子虫小亚单位核 糖体RNA基N66 过优化PCR反应体系，测定线性范围，评价方法的特异性、灵敏度和重复性，成功构建、研制了家蚕微孢子虫的荧光定量PCR 检测方法和诊断试剂。该方法的检测线性范围为1×108—1×102拷贝mL’1的7个线性梯度，检测敏感度达1×102mL。家蚕微孢子 虫，特异性高，3次重复性检测应用试验的批内变异系数为3．6％～7．2％，批间变异系数为5．2％～7．8％。结果表明，建立的家蚕 微孢子虫荧光定量PCR方法具有准确、灵敏、快速、特异性强的特点。 关键词：家蚕微孢子虫；荧光定量PCR；检测；诊断试剂金 家蚕微粒子病是蚕业生产的毁灭性疫病，引起该病害的病原微生物为家蚕微孢子虫(Nosemabombycis， Nb)u1。家蚕微孢子虫不仅可在家蚕幼虫、蛹、蛾体的多种组织内寄生，并能经蚕卵垂直传播给下一代，对 蚕业生产尤其是蚕种生产造成严重危害，而且极易导致丝茧育蚕茧质量的下降，严重影响蚕丝产业链下游 经济的发展。所以，一直来家蚕微孢子虫是各国蚕种生产和进出口贸易的重要检测对象，我国将之列为进 出口动物检疫二类疫病“1。 目前蚕业生产中对家蚕微孢子虫的检测一般采用光学显微镜镜检的方法，但该方法特异性和灵敏度都 不高，也难于实现早期诊断。为了提高检测灵敏度，近10多年来有通过免疫血清学方法和分子生物学技术 单克隆抗体和PCR技术等对家蚕微孢子虫进行检测探索。但PCR技术要通过凝胶电泳来判定结果，容易产 生污染，而血清学方法检测家蚕微孢子不够稳定。本项研究的目的是要建立一种用于家蚕微孢子虫检测的 荧光定量PCR探针方法，即在常规PCR扩增系统中加入一段与靶基因特异互补的荧光标记探针，探针的5’ 灵敏性和特异性，同时，又能避免PCR凝胶电泳产生的污染。 1材料与方法 1．1 材料及主要试剂 家蚕微孢子虫悬浮液(1×108mLl)以及健康蚕蛾样本和健康蚕卵样本，均由浙江 大学蚕蜂研究所提供。 工程菌DH5Q、pMO一18T载体购自TAKARA公司。 1．2方法 1．2．1 引物和探针的设计与合成根据扩增区的保守性和特异性，从GenBank检索家蚕微孢子虫小亚单位 smallsubunitribosomal 核糖体RNA(Nosemabombycis No．FJ854545)，利用PrimerExpress3．0软件设计特异性引物和荧光探针。特异性引物序列：Nb—F (57一AGTGCCATCGTTGCTGGTT一37：Nb—R(57一TGGGCCTTTCTTCTTTCCTAT一3 7)。多乏光够爰针序列：FAM—AACCGCTA AGGAAACCCGC从GGA—TAMRA。 000 1．2．2家蚕微孢子虫发芽和DNA提取取0．5ⅢL浓度为l×108mLl的家蚕微孢子虫悬浮液，5r／min， 000 离心5min，去上清，保留孢子，同时加入0．2mol／LKOH溶液0．25mL，充分混合，27℃诱导1h后5 ·--——826·--—— r／min，离心5min．士-清用05mL