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2012年 3月第 7卷第 8期 ChinaPracMed，Mar2012．Vo1．7，No．8 · 59 · 己糖激酶(Hexokinase，HK-Ⅱ)是肿瘤组织 中糖酵解的 渐升高 (P0．05)。 限速酶 ，它在肿瘤组织中表达的量及活性的增加，使得肿瘤组 2．2 槲皮素作用前后SW480细胞中己糖激酶蛋白表达的比 织在乏氧的情况下为瘤细胞本身的生长和增生提供必需的能 较 正常己糖激酶蛋白主要在胞浆表达，呈棕黄色均匀染色 量 ]。槲皮素具有广谱的抗肿瘤作用 ，但其促肿瘤细胞凋亡 为阳性表达。对己糖激酶表达阳性的样本行图像分析，测其 机制尚未完全明确。本研究旨在对槲皮素促进结肠癌SW480 灰度值作为其表达强度的量化指标。灰度值与实际表达强度 细胞的凋亡机制进行初步探讨。 成反比。己糖激酶在槲皮素作用48h后 ，随槲皮素浓度升高 1 材料与方法 而表达强度逐渐下降，与空白对照相比均具有统计学差异 (P 1．1 材料 人结肠癌SW480细胞株由本实验室保存。RPM 0．05)。 I-1640培养液，美国Hyclone；胎牛血清购 自Gibico公司，噻唑 3 讨论 蓝(MTr)、Annixin—v、PI购 自Sigma公司；槲皮素购于哈药集 恶性肿瘤细胞中糖酵解活跃 ，依靠糖酵解获取能量是其 团制药六厂 ；羊抗HK-Ⅱ多克隆抗体购 自santac]uz，S-P试剂 主要的能量获取方式 J。高糖酵解与线粒体结合型 HKI、 盒购于北京中杉金桥。 HKII高表达相关。实验证实在四种HK的同工酶中，HKⅡ与 1．2 细胞培养与药物处理 采用人结肠癌 SW480细胞系， 肿瘤相关性最大。肿瘤细胞中高水平线粒体结合型HKII能 于37℃、5％CO，饱和温度培养箱中培养。细胞贴壁生长 ，每 抑制肿瘤细胞凋亡，从而继续生长增殖。肿瘤特征性的糖代 2～3d传代一次。槲皮素在培养 中的终浓度分别为 12，5 谢酶类 ，就像肿瘤中其他的调节因子一样，也引起了人们的关 I~mol／L，25 mol／L，50 ~Imol／L，100p~mol／L，200 m0l／L。 注。从一定程度地抑制或影响这类调节因子 ，可以影响肿瘤 空白对照组不加药，以等量培养液代替。 的能量代谢，而正常细胞不受影响。因此，针对 HK-II的治疗 1．3 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 将对数生长的人结肠 可能为治疗高葡萄糖代谢肿瘤提供一个新的策略。通过 癌细胞，2ml／孔接种于6孔板，分别加入槲皮素组和对照组 RNA干扰技术沉寂基因表达来抑制 HK一Ⅱ的合成 ·其可行性 各处理组试剂 ，继续培养24h，收集各处理组细胞 ，用 PBS洗 及有效性已获得实验证实。 涤细胞 ，加入 500 的BindingBuffer悬浮细胞 ，分别加入 5 从既往实验室研究来看，槲皮素都显示出一定的抗癌效 AnnexinV ／FITC和PIlO ，旋涡混匀，室温避光染色 15 果 ，多通过提升 自身免疫力来发挥治疗作用” ，对正常组织 min，进行流式细胞仪的观察和检测。 的损失很小。若能证实其具有直接的抗肿瘤作用 ，将有较大 1．4 细胞免疫化学 常规制作细胞爬片，4％多聚甲醛溶液 意义，可为结肠癌等实体瘤的治疗提供有益的方法和实验依 固定。按免疫组化 sP法步骤进行，用 PBS代替一抗作为 阴 据。在本实验中研究发现，槲皮素具有诱导结肠癌 SW480细 性对照。己糖激酶主要在胞浆表达，呈棕黄色，空白对照呈阴 胞的凋亡的能力 ，并随浓度升高而增强，在此过程 ，己糖激酶 性。200倍镜下随机取5个视野 ，计算每个视野阳性细胞数 ， 的表达水平受到影响，并随槲皮素的浓度升高而表达下降，可 阳性反应者用德国LeicaQ550CW图像分析系统在统一光强 ， 以推测，正是槲皮素抑制了己糖激酶的表达，使得肿瘤细胞的 统一放大倍数 (200)下测量表达情况，以染色最淡的视野为 糖酵解正常程序陷入紊乱，进而诱发了凋亡信号通路 ，促进其 起点，随机选取视野测