瑞氏木霉糖蛋白N-糖基化途径改造初探以及促红细胞生成素的高效表达.pdfVIP

Blot分析证实GnTI 示GnTI和vHb基因在转化子T108中能够稳定遗传。Southren VHb基因在T108中已经成功转录并翻译。 虽然使用CO差光谱法检测VHb的活性结果不甚明显，但是生长曲线显示在 低氧条件下T108的生长速度高于出发菌株M23约10％，显示VHb基因产物有一 定活性。对重组瑞氏木霉糖蛋白N．糖基化模式的检测正在进行中。 在蛋白质表达的研究中，影响外源蛋白产量的因素包括启动子强度以及拷贝 数、信号肽，蛋白质分离纯化步骤等。为构建人源促红细胞生成索在瑞氏木霉中 reesei 的高效表达载体，本文利用本室在r cbhl强启动子基础上构建的4拷贝(每 点)人工启动子，cbhl终止子和CBHI信号肽序列构建了分泌型的人源EPO表达 载体pE。 将EPO表达载体’pE质粒与携带有潮霉素磷酸转移酶基因(hph)的pAN7．1 质粒分别共转化z 步经过初步糖基化改造，已经转入人源N．乙酰氨基葡萄糖转移酶l基因的工程菌 株T108，在含有150mg，L潮霉素的基本培养基平板上各筛选得到78和150个潮 霉素抗性转化子。分别挑取单菌落培养，经I：CR验证，从两种转化子中分别挑选 12。 得到epo基因整合到染色体并且能稳定遗传的转化菌株T47和Tl 在分子水平和蛋白水平对转化子T47和T112进行了验证。对两株转化子的 Dot 和Western reesei中已经转录和翻译，表明重 Blot杂交分析结果表明epo基因在r reesei中成功表达。SDS—PAGE和WesternBlot杂交分析结 组人源EPO蛋白在r 达的蛋白的糖基化程度有所提高。利用BandSean软件计算得出，147所表达的促 红细胞生成素产量约为97．3 mgm，而T112所表达的促红细胞生成素的产量约为 46．7 mgm· reeseicbhl 利用Z 1．4kb长的4拷贝强启动子和1．5kb终止子序列作为同源序 列，构建了分别在N．端和C．端带有6His．tag的人源EPO分泌型同源整合表达载体 reeseiT108， plten和pltec。将plten和pltec表达质粒分别与质粒pAN7．1共转化r 在潮霉素选择培养基上各得到40和43个转化子，挑取单菌落传代培养，经PCR 验证，分别得到epo基因整合到染色体上并且能稳定遗传的菌株N5和C10。对 N5和C10转化子的进一步分子验证和重组蛋白分离纯化工作正在进行中。 本文构建了新的zreesei遗传转化系统，为丝状真菌分子生物学研究的开展提 reesei 供了新的工具；实现了GnTI基因和VHb基因在Zreesei中的成功表达，对z N一糖基化途径进行了初步的改造。 对高效表达人源epo基因所需要的各种元件进行精心设计和选择．选择了经 过糖基化修饰改造的菌株作为宿主，实现了人源促红细胞生成素在丝状真菌瑞氏 木霉中的成功表达。本文工作为以rreesei为宿主菌生产人源药用蛋白．发展瑞 氏木霉为新的药用蛋白生产系统进行了初步探索和奠定了一定的基础。 关键词：瑞氏木霉：糖基化途径改造：血红蛋白．促红细胞生成紊；多拷贝启动 子：融合表达；药用糖蛋白 奉本工作受国家自然科学基金(NO资助 嗜擒蹴伍ermoetinmycessp．CDF的嚣膦Q1懈 权争辉唐晓峰唐兵 (武汉大学生命科学学院，武汉，430072) 摘要：在本实验室分离得到的一株嗜热放线菌Thermoactinomyces sp