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中圜科协第四届优秀博士生学术年会论文集
转化的甘蔗品种福农95．1702为福建农林大学甘蘸研究所新培育的新品种；克隆拟南芥干旱诱导启动
1l
3主要生化试剂
成；DNAMarker．dNTPs捏合物购自上海生物工程有限公司其他试剂购国产分析纯试剂。
1．2方法
l 2I拟南芥干早酯导启动子RD29A的克隆
用CTAB法…1提取拟南芥(Arabidopsis
有限公司合成。PCR扩增反麻体积为50uL．包括0 10×buffer，2uLdNTPs(2．5
5ugDNA模扳．5uL
mmolFL)，luL引物PI(20mmolPL)，luL引物P2(20mmolPL)，0．25uL
至50uL。反应条件为94℃坝变性5 rain。
rain；94C．45s，55℃．40s；72C．1min；35个循环后于72℃保温延伸5
的连接．然后转化大肠杆茁DHSa，(抗生素为100raglJlAmp)挑单茁、落进行重组质粒的鉴定。克隆的FCR产
物序列由上海生工生物工程公司测定。测序结粜用PCgene软件进行序列分析．
1 2．2植物表达载体pPrd．$65T的构建及转化
将pMDIST-Prd 29A质粒用
圈1植物表选辑仲pYrd一$65T构建幽
2．3基因枪转化
轰击。
1 2．4 pP：d一$65T转化愈伤的荧光检测
0,2mot／L+
转化愈伤jil织的胁迫培养；轰击后的愈伤组织仍放回预处理培养基(JDA+Sorbltol
Manmtol
69／L)、NaCL胁迫培养基(MS+2．4-D2toga．+0
复培养3～8天。
荧光显微照相分析转化愈伤：取少量转化的愈伤于清洗后的载玻片上，置于荧光显微镜物镜位置，首
先在普通显微下找到清晰的愈伤视野。激发汞灯，调节滤光片组成．分别用不同波长激发光f绿光、紫外光、
蓝光)J![【射，观察愈伤有无荧光产生。选用不同物镜，分别选择不同祝野下剃察，选择最佳观察效果。
2结果分析
2．1 rd29A基因启动于的克曙与序列分析
2．1．1 rd29A基因启动子的克隆
以提取到的植物材料总DNA为模板，PCR扩增片段约为0．4
载体后在含x-gal和ⅡrrG的固体培养基上长出区别分明的蓝自菌斑。分别提取蓝白菌落质粒．经电泳可
见重组质粒滞后明显，Hindll]+BamHl酶切鉴定．如图3，可见一条04kb左右的条带。与预期相符。
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圈3 pMDI弭州29圳删I+酬I
圈2 PcR产物电诛鉴定圈
21．2 rd29A基因启动子序列分析
bp的TATA盒
(TATAA)．在第70--81碱基问有一12
间育一8
碱基之间．ABA应答因子ABRE位于297～304碱基之间。
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