通过定点突变增强纳豆激酶de热稳定性.pdfVIP

现代食品科技 ModernFoodScienceandTechnology 2015，Vo1．31，No．2 通过定点突变增强纳豆激酶的热稳定性 刘中美，何孝天，崔文碾，周哲敏 (江南大学生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡 214122) 摘要：血栓导致的心脑血管疾病是当前危害人类健康、导致死亡率最高疾病之一，因此近年来溶栓药物及具有溶栓功能保健食 品的研发进展得十分迅速。纳豆激酶因其特有的高效溶血栓作用，成为国内外科研热点之一。本研究针对 目前纳豆激酶稳定性的问题， 以纳豆激酶的晶体结构和序列比对为基础，通过定点突变构建组纳豆激酶突变体，对可能影响纳豆激酶热稳定性的氨基酸进行研究。 在构建的5个突变体中，P14L、N76D两个突变体的热稳定性有明显提高，在65℃下的半衰期由20min分别提高为30min和50rain。 同源建模和分子动力学研究结果表明，这两个氨基酸位点是通过不同机理对纳豆激酶催化活性以及热稳定性产生的重要作用。本研究 可为纳豆激酶的基因工程改造以及其生产和应用提供理论基础和技术支持。 关键词：纳豆激酶；定点突变；热稳定性；枯草芽孢杆菌 文章篇号：1673．9078(2015)2-37-41 DOI：10．13982／j．mfst．1673—9078．2015．2．007 EnhancingThermostabilityofNattokinasebySite-directedM utagenesis LIUZhong-mei,HEXiao-tian，CUIWen-jing，ZHOUZhe-min (TheKeyLaboratoryofIndustrialBiotechnology,SchoolofBiotechnology,JiangnanUniversity,WuXi214122．China) Abstract：CardiovascularandcerebrovasculardiseasescausedbythrombiareofIlenlife—threatening，contributingtothehighestmortality rate．Thishasfuelledrapiddevelopmentofthrombolyticdrugsandfimctionalfoodswim thrombolyticactivityinthepastfewyears．Duetoits strongthrombolyticeffect,nattokinase(NK)has becomehtefocusofinternationalinterest．Theaim ofthiSstudywastoenhancehte htermostabilityofNK．Basedonitssequencealignmentsandcrystalstructure，NK mutnatswerepreparedbysite-directedmutagenesisandthe aminoacidshtatmightaffectNK htermostabilitywerestudied．Amongthefivemutantsgeneratedinthissutdy,P14L andN76D showed significnatlyincreasedhtermostabiliytnadtheirhal~lifeat65℃ improvedfrom20min(wildtype)to30and50min，respectively．Homology modelingnadmoleculardynamicsnaalysisshowedhtattwoma inoacidsitesniflunecedthermostabiliyt nadcatalyticactiviyt ofNKthrough differentmechna isms．Thisstudyprovidesahteoreticalnadtechnicalbasisforhtegeneticreconstruction，production，andapplicationofNK． Keywords：naRokinase；site．directedmutagenesis；htermostabi