胶原蛋白特异性氨基酸测定方法的改进.pdfVIP

LC．159 胶原蛋白特异性氨基酸测定方法的改进 孙玮潘峰王一健 (第三军医大学基础部中心实验室重庆400038) 1前言 胶原蛋白是机体内一组主要的结构蛋白，称为胶原家族。近年来有关胶原家族的研究 使人们对其生化结构和生理作用以及病理条件下的变化有了进一步的认识…。机体中胶原 含量约占总蛋白质的三分之一。而本文中讨论的HYP和HYL则是胶原的特异性氨基酸， 几乎所有的HYP和HYL都存在于胶原中，且含量比较恒定。因此，对胶原总量的测定 常采用胶原中HYP的量来表示”1．人体某些胶原性疾病如肝病、骨病、糖尿病、骨肿病、 乳腺癌、前列腺癌等均可引起皎原代射紊乱，使组织或体液中的胶碌特异性氨基酸的水平 改变”1，准确、快速测定其含量可为胶原性疾病的基础研究、临床研究、诊断、监测和 防治提供可靠依据． 传统测定胶原特异性氨基酸含量和胶原蛋白总量的方法是化学比色法嗍和电泳法嗍， 其操作步骤繁琐，影响因素多，样品需要量大，且准确性差，氨基酸分析仪虽可提供准确、 高灵敏度的测定方法””，但常规的蛋白水解液分析方法耗时太长(90m柚，因此不利于大 批量样品的快速分析以及临床监测。本文介绍了应用6300黄金系统氨基酸分析仪快速测 定HYP和}n几含量的方法。 2材料与方法 2．1试剂 羟脯氨酸，分析纯，上海生化试剂厂；羟赖氨酸。光谱纯，瑞士Fluka公司：缓冲剂 纯，上海生物研究所：二甲亚砜，分析纯，江苏正兴化工研究所；盐酸，优级纯，上海生 化试剂厂；实验用水为超纯水。 2．2仪器 BeckmaIl公司生产的6300黄金系统高效氨基酸分析仪；60l黄金系统色谱工作站； 国产烤箱、水浴锅等。 2．3样品采集 本实验选用日本大耳白兔，月龄8一12个月，体重扣3kg，3％戊巴比妥钠静脉麻醇， 无菌条件下手术造成左尺骨中上段1．2cm骨缺损(连同骨膜一并切除)，随机分为二组，一 组缺损内植入内形态发生蛋白(简称Bh但)，另一组植入单纯载体，分别于术后l。2，3， 4，5周取2只动物缺损内组织标本进行前处理。 2．4组织标本的水解 6mol几Hcl，充氨气2min，抽真空 准确称取1．肚5．omE样本于水解管内．加入5mL 封管，置于烤箱内，1lo℃±l℃水解22~24h，将水解液置于100℃水浴锅上使盐酸充分挥 um微孔滤膜过滤， 发，加超纯水洗涤3次，蒸干，用Nas稀释液定容到2mL，再用0．22 ．350- 滤液各用。 2．5色谱条件 uL，min； 二甲亚砜与茚三酮配制成茚三酮显色剂，流速6mL／h；柱温，40℃，77℃：进样量，50 比色波长，570m，440IlIn。 2．6标准曲线 准确称取HYP和HYL标准样品，用Na-s稀释，使之成为lg，L的标准储备液，将HYP， 进两针．作出标准曲线(线性范围O．2~10．Omg／L)。 2．7程序改进(略) 3实验结果 3．1色谱图 b 0 TlIin 0 3 6 9 IIIin0 3 6 9TIIin 0 5 10面n 5 t0 图1本方法对样品(a)和标准 图2本方法对样品(a)和标准 样品(b)HYP的分析图谱 样品(b)HYL的分析田谱 用常规的蛋白水解分析法完成全过程需90min，耗时太长，如果仅需测定样品中的HYP 和HYL时，则效率太低。采用本文建立的短程序对HYP和HYL进行快速测定时，从上 均为18min，比常规的分析方法分析时问缩短了72min，效率提高了5倍。 3．2回收率和重现性 将一定量的HYP和}rYL标准液分别加入8份样品中．用同样的方法测定HY