高效液相色谱法的研究注射液加替沙星在家兔体内的药代动力学.docVIP

HPLC测定加替沙星血药浓度方法的建立及药动血参数计算 【摘要】加替沙星为8-甲氧氟喹诺酮类外消旋化合物，体外具有应谱的抗革兰氏阴性和阳性微生物的活性，其R-和S-对映体抗菌活性相同。抗菌作用是通过抑制细菌的DNA旋转酶和拓扑异构酶IV，从而抑制细菌DNA复制、转录和修复过程。为了解决了不能用相同房室模型拟合全部实验数据的问题。本实验建立测定血浆中加替沙星药物浓度的高效液相方法，同时采用非房室模型，它的最基本的优点是限制性假设较少，只要求药时曲线的尾端符合指数消除，而这一点比较容易被实验证实。 【关键词】HPLC，加替沙星，药代动力学参数，AUC 实验目的 建立测定家兔血浆中加替沙星药物浓度的高效液相方法,进一步研究注射液加替沙星在家兔体内的药代动力学。 2. 实验原理 HPLC以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。具有高压，高速，高效，高灵敏度的优点。 本实验采用非房室模型，它的最基本的优点是限制性假设较少，只要求药时曲线的尾端符合指数消除，而这一点容易被实验所证实。此外，解决了不能用相同房室模型拟合全部实验数据的问题。例如，有的实验对象其数据符合一房室模型，另有部分对象数据符合二房室模型，很难比较各参数。而用非房室模型分析，不管指数项有多少，都可以比较各组参数，如AUC、MRT、Cl等。但是从另一个角度看，这也是非房室模型的缺点，不能提供药时曲线的细节，只能提供总体参数。具体参数计算如下： ·初始浓度(C0)=D/Vd ·消除速率常数(k)= - k’*2.303 ·半衰期(t1/2) = 0.693/k ·平均驻留时间(MRT)=AUMC/AUC； ·血药浓度-时间曲线下面积(AUC)： ·清除率(CL)= Dose/AUC ·表观分布容积(Vd)= CL/k 材料 3.1 仪器 SHIMADZU HPLC , CTO-10AS 柱温箱，LC-20AT 液相色谱仪，SPD-20A 紫外检测器，进样器，数据处理工作站，高速离心机，涡旋震荡，EP 管，移液器; 健康家兔1 只，体重（2.0kg左右） 3.2 试剂 加替沙星原粉，肝素生理盐水，10%高氯酸，甲醇（色谱纯），15mM/L 醋酸铵溶液，醋酸，乙腈（色谱纯），蒸馏水。 4.实验方法 4.1 色谱条件 色谱柱：Inertsil ODS-SP 4.6×150mm 5μm柱号：OKI92214； 流动相：乙腈：水相=22:78。水相含15mM醋酸铵，醋酸调节PH至3.0； 流速：1ml/min； 柱温：40°C； 检测器：仪器名称：LC20AT； 检测波长：293nm。检测波长的选择：配制一定浓度的加替沙星溶液，用紫外分光光度计在200～400nm处 进行扫描可知，加替沙星的最大吸收波长为293nm，故本实验选择293nm 作为检测波长。 4.2 标准曲线的制备 配置1mg/ml加替沙星标准溶液,取加替沙星标准溶液500μl，加入500μl空白血浆使成500μg/ml，使用空白血浆依次倍比稀释成500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8、3.9μg/ml/ 精密量取0. 4mL置离心管中, 加入内标液50μl及10%高氯酸200 μl，涡旋振荡混匀，高速离心15min取上清液，20μl进样分析。 以加替沙星峰面积与内标峰面积比值对浓度c进行线性回归，得标准曲线方程。 溶液浓度 （ug/mL） 3.9 7.8 15.6 31.2 62.5 125 250 500 峰面积 4.3 血浆样品的处理 血浆样品（100μl）+高氯酸10%（100μl） ↓ 涡旋震荡3min ↓ 离心（12000rpm.10min） ↓ 上清(100μl) ↓ 进样（20μl） 5.注意事项 5.1装柱时要注意方向是否正确。实验做完后，先用10%甲醇洗柱约3分钟，再用90%甲醇清洗； 5.2绘制标准曲线时，可从低浓度至高浓度操作，以减少影响和干扰； 5.3高效液相仪使用之前应调整好柱温，流速等参数，并稳定仪器一段时间，尽量减少系统误差； 5.4检测波长的选择 加替沙星在293nm 处有最大吸收； 5.5在样品的预处理 利用加替沙星在酸性的条件下更易溶与水的特点,直接加入10% 高氯酸一次性去除内源性蛋白等杂质,沉淀效果好,上清液澄清,色谱峰干扰物质少。检测的灵敏度完全能满足体内药物浓度监测、人体药代动力学及生物等效性研究； 5.6调节流动相的pH值，查阅文献得，调节PH分别为5.0、4.0、3.0。其中pH3.0时分离效果好,血浆中杂质无干扰； 5.7柱温的影响，查阅文献，考察了常温, 20℃, 30℃, 4