MIF活性区域相互作用蛋白的筛选.pdfVIP

中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2012，28(10)：1861—1867 · 1861 · [文章编号] 1000—4718(2012)10—1861一o7 MIF活性区域相互作用蛋白的筛选 肖定璋 ，陈少贤 ，陈 景 ，罗 琼 ，黄曙方 ，丁 红 (广东省人民医院，广东省医学科学院 医学研究中心，血液科 ，广东 广州 510080) [摘 要] 目的：筛选与巨噬细胞移动抑制因子(MIF)催化巯基蛋白质氧化还原酶(TPOR)活性域相互结合 的蛋白。方法：采用酵母双杂交系统进行筛选。首先构建pBTM116一MIF诱饵质粒 ，转化酵母菌株 IA0；将表达 MIF催化 TPOR活性域的L40酵母菌株制备成感受态菌，在人骨肉瘤 cDNA文库中筛选。通过组氨酸(HIS3报告 基因活性和B半乳糖苷酶实验，初步确定与催化TPOR活性域片段相互作用的蛋白，最终通过免疫共沉淀和免疫 荧光技术来确认。结果：分别构建含野生型 MIF的pBTM116一MIF和野生型硫氧还蛋 白样蛋 白2(TXNL2)的 pACT2一TXNL2质粒 ，将其共转染 IAO酵母菌。HIS3报告基因活性检测和p半乳糖苷酶阳性实验结果提示TXNL2 可能是与MIF催化 TPOR活性片段相互作用的蛋白。将重组质粒PeDNA3．I—Myc—TXNL2转染MCF7细胞 ，免疫 共沉淀实验结果表明MIF抗体能够共沉淀Mye—TXNL2蛋白；免疫荧光结果显示Myc—TXNL2与 MIF在细胞质中 位置分布相同。结论：TXNL2可能是与 MIF催化TPOR活性片段相互作用的蛋 白。本研究为 MIF氧化还原机制 的研究提供了新的实验依据 。 [关键词] 巨噬细胞移动抑制因子 ；巯基蛋白质氧化还原酶；酵母双杂交系统；蛋白质相互作用；硫氧还蛋 白样蛋白2 [中图分类号] R363．2 1 [文献标志码] A doi：10．3969／j．issn．1000—4718．2012．10．024 Screeningofproteinsinteractingwith activationdomainofmacrophage migration—-inhibitoryfactor XIAODing—zhang，CHENShao—xian，CHENJing，LUOQiong，HUANGShu— fang ．DING Hong (MedicalResearchCenter，DepartmentofHematology，GuangdongGeneralHospital，GuangdongAcademyofMedicalSci- ences，Guangzhou510080，China．E—ma il：Dzhxiao@163．com) [ABSTRACT] AIM：Toscreentheproteinsthatinteractwiththecatalyticthiol—proteinoxidoreductase(TPOR) domainofmaemphagemigration—inhibitoryfactor(MIF)．METHODS：Yeasttwo—hybridsystemwasusedtostudythe proteinsthatinteractedwiht MIF．ThebaitvectorpBTMll6一MIFwasconstructedandtransfectedintoIA0yeaststrain． L40competentcellsexpressinghteTPOR domainwere preparednadusedtoscreentheproteinsinteractingwiht hteTPOR domainofMIFinahumanosteosarcomacDNA library．TheproteinsinteractingwithTPOR domainwereidentifiedbyHIS3 reportergeneandB—galactosidaseassay．Thetechniquesofco— nad