SOD2启动子的克隆及转录活性的检测.pdfVIP

中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2009，25(5)：965—969 · 965 · [文章编号] 1000-4718(2009)05—0965—05 SOD2启动子的克隆及转录活性的检测 张秀娟 ， 王 娟， 刘 铮 ， 王达安， 刘 芸， 姜 勇 (南方医科大学广东省功能蛋白质组学重点实验室，广东 广州510515) [摘 要] 目的：克隆小鼠锰超氧化物歧化酶基因(MnSOD，SOD2)5’非编码区启动子序列 ，通过报告基因 技术检测在静息或脂多糖 (LPS)、亚砷酸钠 (NaAsO)等刺激下该段启动子的转录活性。方法：提取小鼠肝组织基 因组 DNA，PCR扩增小鼠SOD2启动子序列 (一1554～+48)；采用基因重组技术构建 由SOD2启动子驱动的红色 荧光蛋白报告基因载体，将该载体瞬时转染小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF)，荧光显微镜下观察静息或 NaAsO：、LPS、 佛波酯 (PMA)刺激下红色荧光蛋白表达。结果：正确扩增出小鼠SOD2启动子 (一1554～+48)片段；成功构建其 红色荧光蛋白报告基因载体，证实该质粒转染 MEF细胞后静息状态下仅可见少量而微弱的红色荧光 ，经 NaAsO、 LPS、PMA刺激后，红色荧光强度和亮度明显增加。结论：小鼠SOD2启动子 (一I554～+48)在静息状态下即具有 转录活性 ，炎性、氧化应激刺激后SOD2表达增强 ；该启动子的成功克隆和其报告基因载体的构建，为研究SOD2的 基因表达调控机制提供了重要基础和工具。 [关键词] 锰超氧化物歧化酶；启动子；基因，报告 [中图分类号] Q291 [文献标识码] A CloningofSOD2promoterandidentification0fitstranscriptiOnalactivity ZHANGXiu—juan，WANGJuan，LIUZheng，WANGDa—an，LIUYun，JIANGYong (KeyLaboratoryofFunctionalProteomicsofGuangclongProvince，SouthernMedicalUniversity，Guangzhou510515，Chi— na．E—mail：jiang48231@ 163．com) [ABSTRACT] AIM：Toclonethepromotersequencein5’non—codingregion(NCR)ofmurinemanganumSU— peroxidedismutasegene(MnSOD，SOD2)，andtoidentifythetranscriptionactivityofSOD2promoteratrestorinducedby 1ipopolysaccharide(LPS)，NaAsO2，etcinmurineembryonicfibroblasts(MEF)bythereportergenetechnology． METHODS：GenomicDNAwasextractedfrommouseliver，andthepromotersequenceofSOD2(一l554一+48)was amplifiedbypolymerasechainreaction(PCR)method．TheredfluorescentproteinreportergenevectordrivenbySOD2 promoterwasconstructedbygenerecombination technique．Therecombinantvectorwastransientlytransfected intoMEF cells．Theexpressionoftheredfluorescentproteinwasobservedbyfluorescentmicroscopy inMEFcellsatrestorstimula— tedbyNaAsO2，LPSorphorbol一12一myristate一13一acetate(PMA)．RESULTS：SOD2promoter(一1554～+48)0f