应用荧光高效液相法检测心肌磷脂酶D的活性.pdfVIP

维普资讯 中国病理生理杂志 ChineseJounudofPathophysiology 2OO7，23(1)：20l二 · 20l · [文章缩号】 1000—47l8(2OO7)01-0201—02 实验技术 应用荧光高效液相法检测心肌磷脂酶 D的活性 朱 莹 。 蒋珍妮 ， 王建安 ，T．Kurz (浙江大学医学院附属第二医院心内科，浙江杭州310009；德国吕贝克大学临床二所，德国 吕贝克23538) [摘 要】 目的：为心肌磷脂酶D活性的检测提供新的可靠、灵敏的实验方法。方法：提取心肌膜脂质，以 荧光标记的磷脂酰胆碱及乙醇为底物。高效液相色谱条件 ：LiChrosphere100色谱柱 (250mmx4mm，5tun)为固 定相，流动相A液为正已烷一丙醇一冰醋酸 (82：17：1，y： II)，流动相B液为丙醇一水一冰醋酸 (85：14：1， y：)， 柱温 45℃，流速 1mL／min，梯度洗脱。荧光检测：激发波长475nln，发射波长515砌 。结果：PLD标准品在0．625 — 40pmol范围含量与峰面积呈线性关系，相关系数0．999；孵育时间在0—45min，磷脂酰乙醇生成量与孵育时间 呈直线相关；日内及 日间变异系数分别为5．6％、6．9％。小鼠心肌样品色谱图见二酯酰甘油、磷脂酰乙醇、磷脂酸3 个峰，心肌磷脂酶 D活性检测水平为nmol·h～ ·g～。结论：荧光高效液相法是检测心肌磷脂酶 D活性的简便 、 快速、准确、灵敏的实验方法。 [关键词】 色谱法，高压液相；心肌；磷脂酶 D；小鼠 [KEYWORnS] Chromatography，highpressureliquid；Myooardium；Phospholipa~D；Mice [中圈分类号】 R363 [文献标识码】 A 磷脂酶 D(phoaphofipaseD，PLD)表达于心肌细胞的胞 30min，100％；38min，5％；58min，5％。荧光检测 ：激发波长 膜、内质网、高尔基体、细胞核，水解磷脂酰胆碱 (phoaphatidyl- 475nln，发射波长515nIn。 choline，PC)的终末磷酸二酯键，生成磷脂酸 (phosphatidic．3 样品处理 acid，PA)和胆碱。PC是膜脂中含量最高的脂质，约占膜脂 3．1PLD标准品 Q2mUPI．D标准品与4o Q125nenol／L 总量的50％，其被PLD水解是心肌细胞对众多细胞外信号的 BPC 37℃，1000r／min分别孵育0、15、30、45、60、75、90min。 反应 ，如儿茶酚胺、血管紧张素Ⅱ、内皮素一I等。PA是细胞 0．625、1．25、2．5、5．0、10、20、30、40pmol浓度的PLD标 内重要的第二信使，参与心肌细胞 I，4，5一三磷酸肌醇的产 准品分别与40 0．125 mmol／LBPC 37℃、1000r／min孵 生、心肌蛋白的磷酸化、心肌细胞内钙离子浓度的上调、心肌 育30min。 肥厚等等。PLD介导的信号转导被认为是心肌细胞重要的 3．2 小鼠心肌处理 成年雄性 FVB／Nice小鼠 l0只，体重 信号转导途径…。本文介绍一种新颖的荧光高效液相检测 (24．83±I．46)g，由德 国吕贝克大学提供。戊 巴比妥钠 心肌磷脂酶D活性的实验方法。 150me,／kg腹腔注射麻醉。肝素钠 500U／kg腹腔注射抗凝。 开胸剪取心脏，迅速置于 0℃ Krebs—Henseleit液 (成份 材 料 和 方 法 ： mmol／L：NaCI116，KCI4．6，CaCh2．5，MgSO,1．1，NmqCO3 1 仪■与试剂 24．9，C6Hl20610，