活性跟踪法研究地骨皮中抑制NF―κB的化学成分.docVIP

活性跟踪法研究地骨皮中抑制NF―κB的化学成分 　　[摘要] 传统中药地骨皮常用于治疗许多与炎症相关的疾病。该研究目的是确定地骨皮中抑制核转录因子NF-κB（炎症关键调控子）的活性成分。对不同溶剂的地骨皮提取物进行体外抑制NF-κB的活性试验，结果发现乙酸乙酯提取物与甲醇提取物表现出较强的抑制活性。通过活性跟踪分离纯化，获得4种酚酰胺类化合物，分别为：反-对羟基肉桂酰酪胺（1）、反-阿魏酰酪胺（2）、反-咖啡酰酪胺（3）与二氢咖啡酰酪胺（4）。它们对肿瘤坏死因子（TNF-α）诱导的NF-κB活性的抑制率差异非常显著，抑制率大小为342≈1。推测反-咖啡酰酪胺为关键活性成分，其IC50为18.41 μmol?L-1。通过构效关系分析说明，反-咖啡酰酪胺C-3位的羟基可能是与NF-κB结合的高亲合位点，而且C-7，8位双键介导了苯环、羰基的π电子共轭作用，从而形成独特的平面空间构型，有助于抗炎分子与靶标蛋白的空间契合。由此推断，含有α，β-不饱和酮及苯环的迈克尔受体结构与邻二酚羟基共同决定了化合物3的生物活性。 　　[关键词] 地骨皮；核转录因子κB；活性跟踪分离；酚酰胺类；构效关系 　　炎症是人们熟知的病理现象，近几年研究表明炎症也参与了癌症[1]、心血管疾病[2]及2型糖尿病[3]的形成。核转录因子（NF-κB）广泛存在于多种组织细胞中，对细胞信号转导及基因表达调控起重要作用，是炎症启动、调节的关键核因子。NF-κB一般驻留在细胞质中，但被肿瘤坏死因子（TNF-α）或其他氧化应激等因素激活时，就会转移到细胞核中与DNA结合，导致促炎靶标基因的快速转录[4-6]。因此，以NF-κB为靶标筛选其抑制剂，有望获得预防与治疗炎症的高效药物分子。靶标筛选是一种新药筛选研究的模式，另一种是以生理学与表型为基础的筛选模式，2种模式相互补充和印证。当今以靶标为切入点的研究占主导地位，研发出了不少新药[7]。 　　地骨皮Lycii Cortex为茄科植物枸杞Lycium chinense Mill.或宁夏枸杞L. barbarum L.的根皮。主要分布在宁夏、甘肃、青海、新疆等北方省份，南方也有少量引种。地骨皮性味甘寒，归肺、肝、肾经，主要功效为凉血除蒸、清肺降火，一般常用于清虚热，泻肺火，凉血。主治阴虚劳热，骨蒸盗汗，小儿疳积发热，肺热喘咳，吐血，衄血，尿血，消渴等[8]。现代药理学研究也表明，地骨皮具有镇痛[9]、降血糖[10-12]、降血压[13]、降血脂[14]、抑菌消炎[15]、改善胰岛素抵抗[16]等作用[17]。本研究以NF-κB为靶标，采用活性跟踪方法从地骨皮中筛选活性成分，获得了一系列酚酰胺类化合物，并对其构效关系进行了初步探讨。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　地骨皮购自湖南松龄堂中药有限公司，经湖南中医药大学药学院生药学教研室刘塔斯教授鉴定为甘肃枸杞L. chinense的根皮。 　　小牛胎血清（FBS）与Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）购自瑞士巴塞尔Lonza公司；含NF-κB易感荧光素酶的HEK293细胞（RC0014）购自Panomics公司；NF-κB抑制剂阳性对照小白菊内酯（parthenolide），二甲亚砜（DMSO），葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20）来自Sigma-Aldrich公司（北京）；编码绿色荧光蛋白的质粒（pEGFP-N1）购自美国Clontech公司；柱色谱硅胶（100～300目），薄层色谱硅胶板GF254来自青岛海洋化工二厂；其他试剂购自长沙汇弘试剂公司，用于柱色谱的有机试剂在使用前均进行重蒸、干燥处理。 　　1.2 生物活性跟踪分离 　　地骨皮样品于50 ℃干燥48 h后，粉碎至0.5～1 mm 粒径大小。将50 g地骨皮粉末置于500 mL无水乙醇中，在搅拌下冷浸提取3次，每次8 h，过滤，合并提取液，40 ℃减压浓缩至干备用，此为地骨皮的总提取物（TE，2.3 g），用于活性试验。 　　对于活性跟踪分离，将5 kg地骨皮粉末置于20 L石油醚（60～90 ℃沸程）中，在搅拌下冷浸提取3次，每次8 h，过滤，合并提取液，40 ℃减压浓缩至干，得石油醚提取物；过滤后的地骨皮残渣于通风橱中完全风干，按以上步骤依次用20 L二氯甲烷、20 L乙酸乙酯、20 L甲醇与10 L水进行3次冷浸提取，实现按化合物极性初步分离，共获得石油醚提取物（PE，7.2 g），二氯甲烷提取物（DE，83.7 g）、乙酸乙酯提取物（EE，6.6 g）、甲醇提取物（ME，21.4 g）及水提物（WE，100.4 g）。NF-κB抑制活性结果表明，乙酸乙酯提取物与甲醇提取物表现出较强的NF-κB抑制活性，所以仅对这2个部位进行活性跟踪分离纯化。 　　取乙酸乙酯