白木香肉桂酸―4―羟基化酶（C4H）基因的克隆及表达分析.docVIP

白木香肉桂酸―4―羟基化酶（C4H）基因的克隆及表达分析 [收稿日期] 2013-10-28 [基金项目] 国家自然科学基金项目（座机电话号码， 座机电话号码）；北京市自然科学基金项目（座机电话号码）；教育部新世纪优秀人才支持计划项目（2008）；高等学校博士学科点专项科研基金项目（座机电话号码120009）；国家“十二五”科技支撑计划项目（2011BAI01B07）；海南省中药现代化专项项目（2010ZY001， 2012ZY002）；海南省重大科技研发专项（ZDZX座机电话号码） [通信作者] *张争，Tel：（010）座机电话号码， E-mail：zhangzheng321@126.com；*郭庆梅，教授，博士生导师，Tel：1座机电话号码62，E-mail：qmguo@ [作者简介] 梁良，Tel：（010）座机电话号码，E-mail：liangliang0118ll@126.com [摘要] 对国产沉香的基原植物白木香Aquilaria sinensis肉桂酸-4-羟基化酶基因C4H编码区进行克隆，并对其进行生物信息学分析和表达分析。根据已报道的白木香伤害转录组高通量测序结果分析获得1条具有肉桂酸羟化酶酶保守结构域的C4H基因序列，采用RT-PCR技术克隆得到白木香C4H基因编码区序列，并对C4H蛋白进行生物信息学分析。另外，采用qRT-PCR方法对C4H基因在伤害胁迫下的表达模式进行分析。序列分析表明，所克隆的C4H基因编码区开放阅读框（opening reading frame，ORF）长为1 515 bp，编码514个氨基酸，GenBank登录号为KF134783。qRT-PCR实验证明C4H基因受不同伤害处理的诱导，分别在8，20 h达到最高表达水平。白木香C4H基因的编码区序列的分离克隆为进一步研究C4H蛋白在白木香中黄酮及芳香族类化合物合成途径中的功能及表达调控奠定基础。 [关键词] C4H酶； 白木香； 芳香族化合物； 伤害 国产沉香为瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis（ Lour. ） Gilg 含树脂的木材。作为我国传统中药，沉香有具行气止痛、温中止呕、纳气平喘的功效，用于胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐呃逆、肾虚气逆喘急[1]。沉香只有在健康白木香树受到外界伤害后才能形成[2]。但是，伤害诱导沉香形成的分子机制一直未得到清晰揭示， 制约了高效结香技术的建立。沉香的化学成分主要为：倍半萜类、芳香族类成分和2-（2-苯乙基）色酮[3-4]。合成芳香族化合物的苯丙烷途径的关键酶之一是肉桂酸-4-羟基化酶 [5]。研究表明，C4H在转录水平上的丰度和蛋白质水平上的活性能有效影响植物中芳香族化合物和黄酮类化合物的生物合成量[6-8]。本实验根据已知的植物C4H的氨基酸序列进行同源序列比对，设计引物，应用RT-PCR从白木香中克隆C4H基因全长并进行序列分析，了解白木香C4H基因的结构与功能，这对从分子水平上探讨白木香苯丙烷类次生代谢途径具有重要意义。 1 材料 中国医学科学院药用植物研究所温室栽培的3年生白木香茎诱导产生的愈伤分别进行机械伤害（用灭菌后的刀片切割至体积约为5 mm3的小块）和100 μmol?L-1 MeJA（茉莉酸甲酯）处理，于处理后2，4，8，12，16，20，24 h取样，用于提取总RNA，检测C4H基因在健康和伤害后愈伤组织中的表达差异。 2 方法 2.1 总RNA提取 按照EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒（Aidlab，中国）实验操作步骤进行RNA制备，制备好的总RNA最终溶解于30 μL RNase free水中， 1% 琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，分光光度计NanoDrop 2000C （Thermo Scientific， 美国） 测定RNA浓度。 2.2 cDNA第一链的合成 利用TaKaRa公司的M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit 试剂盒将白木香总RNA反转录为第一链互补链DNA （ cDNA）。反转录的反应条件及程序均按照TaKaRa公司的M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit 试剂盒说明书进行。 2.3 C4H基因的克隆 从白木香转录组高通量测序[9]结果中获得1个由表达序列标签拼接而成的序列，经注释分析发现此片段是具有完整开放阅读框的C4H基因，其开放阅读框为1 515 bp，定名为C4H。 根据GenBank （http：//）中报道的植物C4H基因同源性较高的核苷酸序列，设计保守区简并引物C4H-F：CTTCTTCCCGACACAAAATATCT 和C4H-R：CCCAAAACAGTACATTGGACAG。以白木香总RNA的反转录产物为模板，按照下列体系进行扩增：cDNA 3 μL，1