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脱落酸对铁皮石斛Ty1―copia类反转录转座子转录活性的影响 　　[收稿日期] 2013-10-29 　　[基金项目] 浙江省重大科技专项（2012C12912，2011C12002） 　　[通信作者] *高燕会，副教授，从事植物生物技术和品种选育，E-mail：gaoyanhui408@126.com 　　[作者简介] 李聪，硕士研究生，E-mail： lenilc@163.com 　　[摘要] 研究以Ty1-copia类反转录转座子反转录酶区域的简并引物，对100 μmol ?L-1脱落酸（ABA）处理的铁皮石斛进行反转录PCR（RT-PCR）扩增，得到260 bp左右的目的条带，说明100 μmol?L-1的ABA能诱导Ty1-copia类反转录转座子转录活性的表达。将目的条带回收、克隆和测序后分析得到42条Ty1-copia类反转录转座子反转录酶的保守序列，该序列变异性较大，核苷酸序列长度247～266 bp，同源性为46.3%～98.9%。经plantCARE软件分析发现与铁皮石斛基因组所分离的Ty1-copia类反转录转座子一样，存在多个受胁迫条件作用的调控元件、多个启动子的特征结构TATA box和CAAT box的保守序列及其他一些调控元件；但有转录活性的铁皮石斛Tyl-copia RT序列中与胁迫条件作用相关的调控元件明显增加。翻译成氨基酸后，有15条序列出现不同程度的终止密码子突变，19条序列出现移码突变，保守序列“SLYGKQ” 全部发生不同程度的突变。其氨基酸序列经过系统聚类后可分为5类；且与基因组Tyl-copia RT序列聚类后发现多数发生转录的Tyl组反转录转座子RT序列与基因组Tyl组反转录转座子RT序列亲缘关系较远，说明经ABA诱导后发生转录的Tyl组反转录转座子RT序列与基因组Tyl组反转录转座子RT序列有很大的差异。 　　[关键词] 铁皮石斛； 脱落酸（ABA）； Ty1-copia类反转录转座子； 反转录酶（RT）； 转录活性 　　反转录转座子广泛存在于植物基因组中[1]， 能够增加基因组大小，对植物基因组进化也会产生重要作用[2]。由于反转录转座子是以DNA-RNA-DNA进行增殖的转座元件，转录便成为控制其活性表达的关键步骤。一般情况下，反转录转座子以静止状态存在于植物中，但部分反转录转座子仍具有转座潜能，能够被各种生物和非生物胁迫所激活[3]，如包括原生质体分离、组织培养、外伤、脱落酸（ABA）、茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）等非生物胁迫能够大大提高Tntl和Ttol反转录转座子的表达[4-5]。同时许多生物因素也可以导致反转录转座子的转录激活[6]。Tang等[7]在小麦Triticum aestivum L.中发现反转录转座子TaRT-1能够被MeJA，SA及白粉病菌（powdery mildew fungus）诱导，其表达水平明显提高。此外，用乙烯，MeJA，SA，ABA等与胁迫相关的信号分子处理液能够激活其活性。 　　铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo是传统名贵珍稀中药材，现代药理研究表明具有益胃生津、滋阴清热等独特功效[8]。20世纪90年代以来，铁皮石斛组织培养、设施栽培等一系列关键技术取得了重大突破，铁皮石斛产业取得了跨越式发展[9-11]。但铁皮石斛设施栽培存在生产成本高、环境非友好、病害易发生等问题。针对上述问题，浙江省铁皮石斛产业技术战略联盟发明了铁皮石斛原生态栽培技术，而选育抗逆性品种是实现原生态栽培的关键[12]。因此，本文通过铁皮石斛脱落酸（ABA）对其基因组内Ty1-copia类反转录转座子转录活性的影响及具有转录活性的该类反转录转座子的特征研究，了解反转录转座子抗逆机制，以期为铁皮石斛选育抗逆品种提供依据。 　　1 材料 　　供试铁皮石斛种质C15，经浙江农林大学天然药物研发中心斯金平教授鉴定为铁皮石斛D. officinale，原产浙江临安（30°31′N，119°12′E），系铁皮石斛分布的北缘，具有抗寒优势。 　　DNA Ex Taq酶，MgCl2，10×Buffer ，dNTPs，克隆载体pMD18-T Vector，RNAiso Plus（Total RNA提取试剂）试剂盒，cDNA合成试剂盒均购自TaKaRa公司；克隆用大肠杆菌DH5α为本实验室保存；凝胶回收试剂盒购自XYGEN生物技术（杭州）有限公司；引物由上海生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 　　2 方法 　　2.1 材料处理 　　取供试种质种子，在浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地组培室组织培养（光周期 16 h?d-1，温度 25 ℃），培养180 d时取生长良好、发育状态一致的